pylori,感染状态仍然持续存在,其中的免疫调控机制仍不清楚。 微小RNA (microRNAs, miRNAs)是真核生物中一类长度约22个核苷酸的非编码小分子RNA,其编码基因存在于基因组的基因间隔区或内含子中,成熟miRNA由较长的可折叠形成发夹结构的前体转录物经Dicer酶或类似的内切核酸酶加工形成。miRNA通过与靶mRNA的3’-非翻译区(3’-UTR)互补或部分互补结合,使mRNA降解或介导其翻译抑制,参与基因转录后水平调控,在细胞发育、增殖、分化和肿瘤发生等生物学行为中发挥重要作用。 研究表明,miRNAs的表达作为细胞接收外源或内源压力信号后的一种早期反应,参与调控机体免疫应答。但目前关于miRNAs在细菌感染与免疫中的作用还鲜有报道。H. pylori感染引起的由胃上皮细胞等介导的固有免疫应答成为抗感染的第一道防线,因此,本研究首先建立稳定的H. pylori感染人胃上皮细胞模型;利用miRNAs芯片检测H.
pylori感染前后胃上皮细胞的miRNAs表达谱变化,以表达显著差异的miRNAs为研究对象,采用Northern杂交和实时定量PCR技术对其表达进行鉴定;深入研究H. pylori感染诱导miRNAs差异表达的分子机制;并通过生物信息学预测和报告载体系统鉴定其靶基因,详细研究miRNAs在H. pylori感染中调控炎症反应的作用机制。本研究以miRNAs为切入点,展开“H. pylori感染、miRNAs变化与调控炎症”的作用模式和机制研究,对进一步阐明H. pylori感染中的免疫调控机制具有重要意义,更为利用miRNAs靶向干预或治疗炎症相关分子导致的损伤及增强对H. pylori清除提供新的思路。 方法: 1、H. pylori感染相关miRNAs的筛选及鉴定。 建立H. pylori标准株感染人胃上皮GES-1细胞模型;利用miRNAs芯片检测H. pylori感染前后胃上皮细胞的miRNAs表达谱变化,筛选出表达显著差异的miRNAs,并采用Northern杂交和实时定量PCR技术对其在多个H. pylori感染胃上皮细胞模型以及H. pylori感染患者胃黏膜组织中的表达进行鉴定。 CB-839临床实验 2、miRNAs在H. pylori感染中差异表达的机制研究。 以表达显著差异的miRNAs为研究对象,通过多诱导因素综合分析、启动子分析、荧光素酶实验、信号通路抑制剂实验等方法,分析miRNAs在H.
和 pylori感染中表达变化的分子机制。 3、miRNAs在H. pylori感染中的作用研究。 结合生物信息学预测、荧光素酶验证实验、GFP报告载体验证实验、实时定量PCR、Western blot等方法鉴定miRNAs在胃上皮细胞中的靶基因;通过体外过表达或抑制表达miRNAs、RNA干扰、免疫荧光等实验深入研究miRNAs在H. pylori感染中调控炎症反应的作用机制。 结果: 1、H. pylori感染相关miRNAs的筛选及鉴定。 H. pylori 26695标准株与人胃上皮细胞GES-1共培养24h后,细胞形态呈明显“蜂鸟样”改变;细胞分泌大量促炎细胞因子Interleukin-8(IL-8);表达启动炎症反应的关键酶Cyclooxygenase-2(COX-2),成功建立感染模型。miRNAs芯片结果表明,H. pylori感染引起GES-1细胞一系列miRNAs的表达改变,其中表达上调2倍的有:miR-155、miR-146a、miR-16、miR-92b、miR-30b;表达下调2倍的有:miR-324、miR-181b。以表达变化最明显的miR-155和miR-146a为研究对象,通过Northern杂交和实时定量PCR技术对其表达进行验证,结果与芯片结果一致;且miR-155和miR-146a在其他多个H.
pylori感染胃上皮细胞模型中表达均明显上调(P
急性肺损伤(acute lung injury, ALI)/急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)为临床常见的危重症,主要表现为急性呼吸窘迫、顽固性低氧血症和非心源性肺水肿。ALI/ARDS可发生于任何年龄段的患者,通常由严重感染、创伤、休克等因素诱发。但迄今为止其发病机制尚未完全阐明。近年来,病理研究结果显示,ALI/ARDS发生时受损伤最明显的结构是肺泡上皮,尤其是肺泡Ⅰ型上皮细胞(AT-1)对损伤更敏感,而且这种损伤常常发生在ALI/ARDS的早期阶段。 小窝蛋白(Caveolin, Cln)是一个相对分子质量为21-24kD的膜蛋白,高度富集于蛋白小窝膜(Caveolea, Cle),是Cle的标志性蛋白,具有多种潜在功能,在维持Cle形态、结构、功能中起重要作用。目前发现,哺乳动物中至少存在3种Cln基因家族产物,即Cln-1,Cln-2及Cln-3。其中Cln-1广泛存在于肺泡Ⅰ型上皮细胞膜,并有证据表明Cln-1/Cle在肺泡上皮屏障功能变化中扮演重要角色。 很少 本研究应用pRNAi-u2.6-Cln-1慢病毒载体转染原代培养肺泡Ⅰ型上皮细胞(AT-1)和c57BL6小鼠,并观察Caveolin-1基因对LPS致炎AT-1细胞和小鼠的影响及作用机制,为临床防治ALI/ARDS提供新的思路。 研究内容和方法: 1.小鼠Cln-1基因的克隆及载体构建:PCR法扩增Cln-1 cDNA全长基因序列,将其克隆至慢病毒表达载体pRNAi-u2.6上并进行慢病毒包装。 2.肺泡Ⅰ型上皮细胞分离、培养:PE标记的AT-1细胞特异性抗体RTI40标记细胞,采用抗PE的免疫磁珠阳性筛选AT-1细胞,流式细胞仪测定纯度。 3.慢病毒载体pRNAi-u2.6-Cln-1转染AT-1及鉴定:慢病毒载体pRNAi-u2.6-Cln-1病毒上清转染AT-1细胞,转染后在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光,流式细胞仪测定转染效率,用Western-blotting法鉴定转染AT-1细胞中目的蛋白表达情况。 4. Cln-1基因对LPS致炎AT-1细胞的影响及作用机制: (1) LPS致炎AT-1细胞模型:AT-1细胞分为转染目的基因的实验组及转染空载体的对照组,均给予LPS刺激,浓度10μg/ml,分2hr和4hr两个时相点。 (2) ELISA法测定LPS致炎细胞上清液的炎性因子TNF-α、IL-6表达水平。 (3)荧光定量PCR法检测LPS致炎AT-1细胞cPLA2和p38 MAPK mRNA表达变化。 (4) Western blotting法检测LPS致炎AT-1细胞cPLA2、p38 MAPK蛋白表达变化。 (5) EMSA法检测LPS致炎AT-1细胞核蛋白NF-κB表达变化。 (6)特异性阻断cPLA2、p38 MAPK、NF-κB后,细胞上清液TNF-α、IL-6表达水平变化及相互作用。 5.观察Cln-1基因对LPS致炎小鼠的影响及作用机制: (1)慢病毒载体pRNAi-u2.