3%(19/35)和17.1%(6/35),血清和肿瘤组织EGFR基因突变的一致率为60%(21/35),Ⅲ和Ⅳ期患者血清EGFR基因突变率(35.7%,5/14)显著高于Ⅰ和Ⅱ期患者(4.5%,1/21)。结论
血清游离DNA为监测Ⅲ和Ⅳ期肺癌患者原发肿瘤中EGFR基因突变提供了新的来源。Scorpions ARMS是检测血清游离DNA和原发肿瘤组织中EGFR基因突变的可靠有效方法。磁珠法是是提取血清DNA的有效方法。
肝细胞生长因子受体(hepatocyte growth factor receptor, HGFR),又称c-Met (mesenchymal-epithelial Selleck transition, MET),是在80年代发现的原癌基因产物,现已确定为受体酪氨酸激酶家族中的成员。HGF最初是作为大鼠肝细胞丝裂原(mitogen)而被发现,其作用与扩散因子(scatter factor)相似。现已证明,HGF主要由基质细胞产生,通过其受体c-Met,能刺激上皮细胞等细胞的增殖,运动,形态发生(morphogenesis)和血管生成。 在正常生理情况下,HGF与受体c-Met结合导致受体激酶区的酪氨酸发生磷酸化,进而导致受体及其下游信号通路的激活,在维持机体器官的发育和组织内环境稳定中发挥重要的作用。然而,HGF异常分泌,c-Met突变,扩增(amplification)以及高表达导致的c-Met通路的异常激活,可引起c-Met受体的持续激活与磷酸化,从而持续不断地激活下游信号通路,导致细胞的异常增殖,诱导正常细胞向癌细胞转化。 有许多方法用来抑制异常的HGF/c-Met信号通路,包括：HGF环状异构体拮抗剂(HGF variant antagonist),HGF抗体拮抗剂(HGF antibody antagonist), c-Met抗体拮抗剂(c-Met antibody antagonist)以及小分子c-Met抑制剂。目前发现的小分子c-Met抑制剂绝大多数都是作用在受体酪氨酸激酶的抑制剂。绝大多数化合物都通过与c-Met受体激酶区ATP口袋(ATP binding site)结合,抑制酪氨酸残基的磷酸化,抑制c-Met通路持续异常激活导致的肿瘤细胞异常增殖和生长。 间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)是胰岛素受体酪氨酸激酶家族成员之一。ALK在肿瘤中的异常改变主要是基因移位,异常的移位导致许多ALK融合蛋白(ALK fusion protein)产生,并持续激活ALK,导致肿瘤细胞的异常增殖和生长。同时抑制c-Met和ALK已经证明在胶质母细胞瘤等肿瘤细胞中有协同效应。因此,研究同时作用于c-Met和ALK的双重激酶抑制剂(c-Met/ALK
dual inhibitor)是非常有前景的抗肿瘤药物。美国FDA于2011年批准了c-Met/ALK双重抑制剂克唑替尼(Crizotinib)用于治疗有EML4-ALK融合蛋白形成的非小细胞肺癌患者。 虽然c-Met和ALK的双重激酶抑制剂是非常有前景的抗肿瘤策略,但在文献中报道的此类抑制剂很少,除Crizotinib外,还有一个是Xcovery公司研发的X-396,目前在进行一期临床试验。我们实验室多年来一直开展c-Met抑制剂的研究,本论文是在实验室前期的工作基础上,综合文献报道的结果以及临床上应用c-Met/ALK双重抑制剂克唑替尼(Crizotinib)成功的策略,设计和合成新的作用于c-Met和ALK的化合物,旨在发现新的高活性和高选择性的c-Met/ALK双重抑制剂。
HKI-272供应商 主要的实验方法和实验结果 一.SMU系列螺环化合物的设计与合成以及分子对接模拟 在我们实验室之前有关c-Met抑制剂的研发中,发现了一类螺环化合物是有效的高选择性c-Met抑制剂,这些化合物分子中的螺环片段能很好地适应c-Met的ATP结合口袋,而c-Met/ALK双重抑制剂克唑替尼分子中含有典型的激酶铰链区结合基团,即2-氨基吡啶。据此,我们的设计思路是：将螺环片断与激酶铰链区结合基团2-氨基吡啶片断结合成一个新的化合物,可能同时具有c-Met/ALK的双重阻断作用?因此,我们设计了3-位由带手性取代基的苄氧基取代的2-氨基吡啶化合物SMU-A及SMU-B;考虑到2-氨基吡嗪基与2-氨基吡啶基的相似性,又设计了毗嗪化合物SMU-C及SMU-D。上述四个化合物分子中都具有一个手性基团,化学合成难度高。为了减小化学合成的难度,我们除去3-位取代苄氧基中的手性甲基再设计了非手性化合物SMU-E及SMU-F。 然后,我们对设计的化合物与c-Met激酶晶体结构进行了分子对接模拟,发现这些化合物都能与激酶晶体结构进行对接。6个化合物根据Surflex-Dock程序的打分值依次如下：8.68,8.67,9.11,8.95,6.70和6.91,克唑替尼为8.67。以化合物SMU-B为例,c-Met激酶的ATP口袋能够很好地接纳SMU-B,并与其形成多个包括氢键、π-π堆积作用、范德华力等相互作用。在c-Met激酶晶体结构中,SMU-B能与克唑替尼很好地叠合,除了靠近溶剂区的部分,SMU-B与克唑替尼几乎达到完美的重叠一致。此外,SMU-B也能与ALK激酶晶体结构的ATP口袋很好地对接。由此预测,SMU-B应该具有对c-Met和ALK激酶的双重抑制作用。于是,我们合成了六个SMU系列的螺环化合物拟进行下一步的研究。 时间 二.SMU系列螺环化合物对c-Met和ALK激酶高选择性活性的确认 为了验证上述计算机分子模拟的结果,我们首先检测了化合物对细胞中c-Met激酶活性的影响。结果发现,六个化合物对MKN45胃癌细胞中c-Met激酶有显著抑制活性,IC50值依次为0.020,0.019,0.023,0.012,>10和9.0μM,克唑替尼为0.020gM,与计算机分子对接模拟的预测一致。进一步对上述化合物的生物利用度研究结果表明,SMU-B的口服生物度达到48%,因此确定该化合物进入下一步研究。 首先采用美国KINOMEscanTM公司的激酶高通量筛选技术,评价了SMU-B对人96种蛋白激酶生化活性的影响,发现SMU-B在100nM浓度下仅对c-Met,ALK和AXL三种受体酪氨酸激酶活性有显著的抑制活性,抑制率分别为94.4%,91.2%和95.