共计74例病例入组,其中男38例(51.35%),女36例(48.65%),男女比例为1.05:1;年龄跨度4岁半-48岁,未成年42例(56.75%),成年3(243.25%)例;缺血型病例62例(83.78%),出血型病例12例(16.22%)。74例患者均行双侧EDAS术,共148侧例手术半球。EDAS术后复查DSA时间为3个月-55个月,平均15.1个月。本组病例在性别构成上男性稍多于女性;年龄构成上未成年患者较成年患者更多;发病类型构成上缺血型多于出血型。术前头颅MR显示,148侧例手术半球中存在脑缺血的共计98侧例;术前头部PET显示,148侧例手术半球中存在脑糖代谢异常的共计106侧例;术前头颅DSA显示,148侧例手术半球中铃木分期Ⅰ期14侧例,铃木分期Ⅱ期21侧例,铃木分期Ⅲ期38侧例,铃木分期Ⅳ期33侧例,铃木分期Ⅴ期28侧例,铃木分期Ⅵ期14侧例;148侧例脑半球中存在颈外动脉颅内代偿的共计92侧例。

确认细节 2.本组病例术前头颅DSA检查结果显示:74例烟雾病患者共148例侧手术半球中存在颈外动脉颅内代偿的共92侧例半球,其中74侧例左半球中存在颈外动脉颅内代偿的共50例侧半球,74侧例右半球存在颈外动脉颅内代偿的共42例侧半球。92侧例有代偿的半球中,通过上颌动脉向颅内代偿共2例;通过上颌动脉+枕动脉向颅内代偿共1例;通过上颌动脉+脑膜中动脉向颅内代偿共1例;通过脑膜中动脉向颅内代偿共53例;通过脑膜中动脉+颞浅动脉向颅内代偿共9例;通过脑膜中动脉+枕动脉向颅内代偿共9例;通过脑膜中动脉+枕动脉+颞浅动脉向颅内代偿共1例;通过脑膜中动脉+枕动脉+上颌动脉向颅内代偿共1例;通过颞浅动脉向颅内代偿共7例;通过枕动脉向颅内代偿共6例;颞浅动脉与枕动脉沟通后共同向颅内代偿2例。脑膜中动脉颅内代偿在所有代偿途径中所占比重最大,占所有代偿途径的57.6%。 3.74例患者均行双侧EDAS术,共148例侧手术半球,血管重建效果0级共32侧例半球;Ⅰ级26侧例半球;Ⅱ级38侧例半球;Ⅲ级52侧例半球。 4.铃木分期对烟雾病自发性颈外动脉颅内代偿形成有显著影响(P
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种常见且致残率极高的严重危害人类身心健康的系统性自身免疫性疾病。其病理上的特征表现为滑膜细胞的“肿瘤样”增生、炎性细胞浸润、血管翳的形成以及关节软骨和骨的进行性破坏。RA的发病机制十分复杂,涉及多种细胞、多个细胞因子以及多条信号通路之间的相互作用,尽管人类在过去的数十余年里对RA的病理生理进行了广泛而深入的研究,也取得了突破性的进展,但其发病机制至今尚不完全清楚。因而有必要对RA的发病机制进行更深一步的研究与探索,寻找到更多新的可能的治疗靶标。

白细胞介素-32(interleukin-32, IL-32)是新发现的一种存在六种或更多剪接变异体的炎性细胞因子。研究发现,IL-32高表达于RA滑膜的活组织检测中,而在骨关节炎的滑膜组织中没有检测到IL-32的表达。IL-32可通过多条信号转导途径,促进细胞分化,参与细胞凋亡,诱导其他致炎细胞因子和趋化因子的生成,在炎症反应、心血管疾病和自身免疫性疾病等方面发挥着重要作用。IL-32γ是最长的剪接变异体,且表现出最强的生物活性。本研究通过体外实验,探究IL-32γ对类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞(RA-FLS)的增殖和分泌的影响以及其信号调节途径。通过MTT的方法发现了IL-32γ促进RA-FLS增殖的最佳浓度为100ng/ml。通过细胞免疫组化的方法发现IL-32γ是通过NF-κB信号通路来促进FLS增殖。采用流式细胞术检测IL-32γ对RA-FLS增殖的细胞周期的影响,发现它是通过促进S期向G2期转换来促进细胞增殖的。用RT-PCR的方法检测了在培养基中加入了IL-32γ刺激后对RA-FLS中IL-6表达量的影响,用同样的方法检测了在分别加入SB203580(p38MAPK抑制剂)、SP600125(JNK抑制剂)、PD98059(Erk1/2抑制剂)三种MAPKs信号通路的抑制剂30min后再在培养基中加入IL-32γ刺激后对RA-FLS中IL-6表达量的影响,结果表明IL-32γ可以促进IL-6的表达,但加入这三种抑制剂后发现只有加了PD98059后IL-6的表达量减少了,说明IL-32γ是通过激活Erk1/2信号途径来上调IL-6表达量。

INK128 此工作为探究IL-32在RA的炎症反应过程中的作用及其可能的作用机制打下了基础,从而为RA的治疗提供理论基础、实验依据和新的可能的治疗靶标。
目的:初步探讨Gas6在预适应中对大鼠心肌细胞缺氧|复氧损伤的保护作用及机制。 SP600125溶解度 方法:选择心肌细胞株H9C2建立实验模型,实验分为5组:①正常对照组:正常培养H9C2细胞;②缺氧复氧组:缺氧2h,再复氧24h;③预适应组:先缺氧20min,再复氧45min,随后再缺氧2h,再复氧24h;④加外源性重组人生长停滞特异性蛋白6(rhGas6)组:加入终浓度为100ng/ml的rhGas6,余同缺氧复氧组;⑤Gas6+LY294002组:加入终浓度为100ng/ml的rhGas6和终浓度为10umol/L的PI3K通路阻断剂LY294002,余同缺氧复氧组。应用流式细胞术测细胞凋亡率,测LDH活性了解心肌细胞受损程度;real time -PCR法测Gas6mRNA表达;免疫印迹法测(Western blot)测定磷酸化Akt、FoxO3a蛋白的表达。 结果:预适应组Gas6 mRNA表达高于缺氧复氧组(P〈0.05);与缺氧复氧组对比,预适应组和Gas6组LDH的活性及细胞凋亡率明显降低(P〈0.05), p-Akt和p-FoxO3a蛋白表达明显增高(P〈0.05);与Gas6组对比,Gas6+LY294002组LDH的活性及细胞凋亡率明显增加,p-Akt和p-FoxO3a蛋白表达明显减少(P〈0.

研究目的：(1)探讨周期性牵张力对血管平滑肌细胞ACE2表达的影响；(2)明确ACE2在病理性牵张力(18%

elongation, 1Hz)调节人主动脉平滑肌细胞生物学功能中的作用；(3)明确病理性牵张力(18% elongation, 1Hz)调节血管平滑肌细胞ACE2表达的分子机制。3.研究方法3.1.人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)培养与处理3.1.1.平滑肌细胞培养人主动脉平滑肌细胞株购自美国菌种保藏中心ATCC (American Type CellCollection),待平滑肌细胞生长至完全融合后,用吸管吸掉旧培养基,PBS冲洗细胞两遍,在细胞培养瓶中加入适量事先预热的0.25%胰蛋白酶,显微镜下观察,至平滑肌细胞变圆后,轻轻拍打至细胞脱落,加入适量完全培养基中和胰酶,吹打细胞,使平滑肌细胞全部掉落,离心5min (1000r/min)。离心结束,用吸管吸掉上清,加入新的完全培养基,转入新的细胞培养瓶中,将培养瓶放入含5%C02的37℃细胞培养箱中继续培养。待平滑肌细胞贴壁完全后,显微镜下观察细胞形态及密度。3.1.2.平滑肌细胞干预体外培养的4-7代HASMCs用于实验。将平滑肌细胞种至铺有Ⅰ型胶原的Flexcell六孔板中。待平滑肌细胞在六孔板中的密度达到80%-90%时,更换无血清SMCM继续培养24小时。牵张力刺激平滑肌细胞前再次更换新的完全培养基。在37。C,5% 不 C02条件下,使用Flexcell 5000-Tension系统刺激平滑肌细胞。不同牵张力描述如下：(1)生理性牵张力:10% elongation,频率为1Hz；(2)病理性牵张力：18% elongation,频率为1Hz。3.2.动物模型的建立我们应用大鼠腹主动脉缩窄模拟血管压力负荷升高,20只雄性Wistar大鼠(200-250g)随机分为两组：腹主动脉缩窄组(n=10)和对照组(n=10),分别于术后3、5及7天后取材。3.3.实时荧光定量PCR分析刺激结束后利用Trizol法提取平滑肌细胞中的总RNA,并测定RNA浓度。根据试剂盒说明,使用TaKaRa公司的cDNA合成试剂盒进行逆转录反应,再使用TaKaRa公司的实时定量PCR试剂盒进行PCR反应。反应结束后得到Ct值,用相对定量的方法计算2-△△Ct,并分析数据。以测定平滑肌细胞内ACE2及ACE的mRNA表达情况。3.4.蛋白质印迹法(Western

时间 Blot)提取不同刺激后的平滑肌细胞及大鼠组织蛋白,4摄氏度离心10分钟,99摄氏度晃动加热10分钟,SDS-PAGE电泳,转膜,5%脱脂奶粉封闭,4摄氏度一抗孵育过夜,室温下二抗孵育2小时,ECL化学发光,利用Photoshop分析对应蛋白条带的灰度值。3.5.ACE2活性测定刺激结束后,提取平滑肌细胞蛋白,以7-Mca-YVADAPK(Dnp)作为反应底物测定不同刺激条件下ACE2的活性变化情况。3.6.酶联免疫吸附测定(ELISA)收集不同刺激条件下平滑肌细胞上清液,ELISA法检测上清中血管紧张素1-7及血管紧张素Ⅱ的含量。3.7.构建含目的基因的病毒载体由上海吉凯基因化学技术有限公司构建过表达ACE2基因腺病毒载体(Ad-ACE2),以携带绿色荧光蛋白的腺病毒空载体(Ad-GFP)为对照组。3.8.5-澳脱氧尿嘧啶核苷法(BrdU)用Brdu法检测ACE2在病理性牵张力(18%

elongation,1Hz)调节HASMCs增殖中的作用。将HASMCs种在Flexcell六孔板中,进行不同刺激。刺激结束后,吸掉旧SMCM,加入适量配制好的BrdU labeling medium作用6小时。将平滑肌细胞用95%7,醇在-20摄氏度固定30分钟,经anti-Brdu working solution4摄氏度孵育过夜、anti-mouse-Ig-fluorescein标记的二抗37摄氏度避光孵育30分钟,4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-Diaxnidino-2-Phenylindole, CP-673451临床试验 DAPI)染核后封片,光学显微镜下观察、拍照。3.9.细胞划痕实验用细胞划痕实验检测ACE2在病理性牵张力(18% elongation, 1Hz)调节HASMCs迁移中的作用。3.10.细胞转染利用Invitrogen公司的Lipofectamine2000分别转染不同浓度的Dicer siRNA、 ATF3 siRNA、Negtive control siRNA及miR-421 inhibitor和mimics,观察ACE2mRNA及蛋白的表达变化,验证ATF3及miR-421是否参与ACE2表达调节。DicersiRNA、ATF3 siRNA、Negtive control siRNA及miR-421 inhibitor和miR-421 mimics均由上海吉玛公司合成。3.11.

应用半定量RT-PCR检测转染后Rac1 mRNA的水平,应用Western-blot检测转染pRac1miR/GFP-733重组质粒后Rac1基因的蛋白表达水平。 4.观察转染后细胞生长情况,应用MTT试验观察转染的靶向Rac1的重组质粒对喉癌细胞体外增殖的影响。 5.通过吖啶橙染色及流式细胞术检测喉癌细胞凋亡情况。通过细胞爬片组化染色观察Hep-2细胞的形态学变化。 结果1.Rac1蛋白在对照组中无表达,在喉癌中染色阳性率为69%,显著高于癌旁组织的阳性率12%,喉癌组织与癌旁组织及对照组比较差异有显著性(均P
随着骨组织工程研究的不断发展,种子细胞的来源、培养、诱导、增殖、分化等研究成为近年来骨组织工程进行研究的热点。间充质干细胞具有能大量增殖、分化为多种组织细胞和表达外源目的基因等优点,并且可以在特定的条件下定向向成骨细胞分化,因其可能成为用于临床的组织工程化骨种子细胞而受到越来越多的关注。 近年来体外冲击波疗法正被广泛的用于治疗骨不连、骨折延迟愈合和股骨头坏死以及运动系统慢性劳损性疾病,并取得了很好的疗效。人们发现,机械物理刺激促使间充质干细胞分化。冲击波作为一种机械物理刺激能够促使间充质干细胞向成骨细胞分化,但这一过程不是自发完成的,其中可能涉及到多条信号通路的调控,其中MAPK通路可能起着极其重要的调节作用,但具体通过MAPK传导路途径的ERK、JNK以及p38MAPK通路中哪一条通路参与以及各通路在诱导成骨分化过程中的作用尚不十分清楚。本试验通过前期获得最佳冲击波(工作电压为8.5kv,作用频次为120次)作用于分离培养后的人骨髓间充质干细胞,设立空白对照组,并分别加入ERK、JNK以及p38MAPK通路抑制剂,通过western

点击此处 blot检测ERK、JNK以及p38MAPK的磷酸化以及MAPK通路作用底物AP-1(c-fos和c-jun mRNA)的表达。用MTT法检测细胞增殖,用成骨特性鉴定的方法(钙-钴法染色检测碱性磷酸酶的表达及其活性、Von Kossa染色检测钙结节和钙沉积量的检测)判断冲击波是否诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,研究ERK、JNK、p38

MAPK通路在体外冲击波诱导下人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中的作用。 本研究发现在冲击波诱导人骨髓间充质干细胞诱导向成骨细胞分化过程中,通过Western blot方法证实ERK、JNK以及p38MAPK通路均早期磷酸化激活,提示ERK、JNK以及p38MAPK通路均参与了成骨细胞增殖、分化。应用ERK、JNK以及p38MAPK通路相应的阻断剂研究结果表明:ERK通路促进人骨髓间充质干细胞增殖,抑制ERK通路后细胞增殖作用明显降低。抑制JNK通路后向成骨细胞分化作用虽有降低,但不具有统计学意义;对细胞增殖未见有明显作用。抑制p38MAPK通路后MAPK作用底物AP-1 (c-fos和c-jun mRNA)表达明显受抑制,成骨鉴定证实向成骨细胞分化作用明显降低,并呈剂量依赖性;低浓度的p38MAPK抑制剂反而促进细胞增殖。应用阻断剂后行同样条件进行诱导,提示p38MAPK通路是冲击波诱导人骨髓间充质干细胞诱导向成骨细胞分化的主要途径。
中草药可抗炎被人们所深信,为数众多的中草药常被宣称具有抗炎的功效,然而大多数缺乏科学性的佐证。因此,若能构建一套可筛选中草药或其提取化合物抗炎的评估方法,尤其使用以分子及细胞学为基础的被国际上认可的方法,在开发中草药的抗炎功效是一项非常重要的发展策略。核转录因子(nuclear LBH589 factor,NF)-κB是调控基因转录的重要因子,活化的NF-κB可控制许多基因的表达,包括参与炎症反应的多种细胞因子、化学趋化因子以及许多免疫系统的受体,NF-κB可谓是免疫系统的中心枢纽。NF-κB的适度活化对于机体抵御病原微生物的危害具有重要意义,但NF-κB过度活化并导致多种炎症介质的过量表达释放则是引起SIRS、急性呼吸窘迫综合征以及MODs发生的重要机制。因此,构建快速与特异的NF-κB活性检测方法,发现以NF-κB为靶点的化合物,将为炎症和肿瘤防治开辟一条新的途径。在本研究中,我们将pNF-κB-分泌型胎盘碱性磷酸酶(secreted

alkaline phosphatase,SEAP)-新霉素磷酸转移酶(neomycin phosphotransferase,NPT)质粒成功地转入小鼠RAW 264.7单核巨噬细胞,该转染细胞含有NF-κB基序的增强子、SEAP报告基因和新霉素(neomycin)抗性筛选基因,通过检测SEAP报告基因表达水平可反映NF-κB的活化状态。另外,我们在实验体系中引入已知的NF-κB激活剂脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),结果证明LPS可以时间和剂量依赖性地促进pNF-κB-SEAP-NPT转染的RAW 264.7细胞的SEAP报告基因的表达。由于LPS使NF-κB活化至一定水平,提高了实验体系中SEAP基础水平,有利于发现待测化合物的NF-κB抑制作用。该筛选体系具有稳定、特异、高通量等特点,利用该体系,我们对61种中药单体进行了活性筛选,并从中发现了一些对LPS诱导的NF-κB的活化具有较强抑制作用的化合物。一氧化氮(nitric oxide,NO)为炎症反应的标志之一,为了进一步对待测化合物进行抗炎活性筛选,本文利用LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞为模型,测定了各待测化合物对LPS诱导的NO产生的影响,结合NF-κB活性抑制筛选结果,我们从诸多化合物中选择了三个既对NF-κB活性具有抑制作用,又能减少NO生成的化合物进一步考察其抗炎活性及作用机制。 BMS-907351体外 其中,从厚朴中提取的新木脂素4-methoxyhonokiol及首次从枳实中提取的三萜类化合物21(α,β)-methylmelianodiol均对LPS诱导的NF-κB活化及NO的生成具有显著的抑制作用。因此,本文应用现代药理学研究手段,首先考察了4-methoxyhonokiol和21α-methylmelianodiol(21α-MMD)对多种急性炎症动物模型的影响,进而应用细胞培养技术、荧光分光光度法、紫外分光光度法、免疫印迹和多聚酶链式反应等方法,在分子、细胞及整体动物水平系统地研究了4-methoxyhonokiol和21α-MMD的抗炎作用及其机理。毛细血管通透性增加是急性炎症反应的一个重要特征,醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加实验则是研究炎症初期反应的一个典型的体内炎症模型,另外,角叉菜胶致足肿胀模型也是一个公认的评价药物抗炎作用的经典方法。因此,我们首先利用这两个模型考察了4-methoxyhonokiol和21α-MMD的体内抗炎活性。实验结果表明:4-methoxyhonokiol(20mg/kg和100mg/kg,i.p.)和21α-MMD(20mg/kg和100mg/kg,i.p.

CD8+Treg、NKTTreg和双阴性Treg细胞四大类。其中,CD4+CD25+Treg细胞是目前研究最为广泛的Treg细胞。CD4+CD25+Treg细胞除表达CD25分子外,还表达一系列免疫调节相关的标志物,如细胞表面的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxic

RO4929097订单 T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(Glucocorticoid induced tumor necrosis factor receptor, GITR)家族相关基因和细胞核内的叉头／翼状螺旋转录因子P3(Forkhad box P3, Foxp3)。Foxp3是Treg细胞维持自身免疫平衡所必需的分子。体内和体外实验都已证明,转化生长因子β1(Transforming growth factor β, TGF-β1)可诱导CD4+T细胞表达Foxp3,形成具有免疫抑制功能的Treg细胞。 丫δ T细胞因其表面表达由γ链和δ链组成的T细胞受体(T cell receptor, TCR)而得名,在抗原识别和免疫应答中具有特殊的作用。γδT细胞主要分布于皮肤、小肠、肺和生殖器官等粘膜及皮下组织,而在人类外周血中,TCR γδ约表达于0.5%-10%的CD3+T细胞表面。γδ T细胞又根据δ链的不同分为V81T细胞和V82T细胞两种类型。Vδ1T细胞多位于小肠上皮组织中,是小肠上皮内淋巴细胞(Intestine intraepithelial lymphocytes, iIELs)的重要组成部分,而其在外周血中的数量仅为γδT细胞总量的20%；V82T细胞主要见于外周血,约占γδT细胞总量的70%。Vδ2T细胞具有显著的细胞毒性作用和对微生物重复感染的记忆反应功能。由于人类外周血中V81T细胞含量较少,并且体外扩增存在一定难度,因此对外周血中Vδ1T细胞的生物学特性和功能知之甚少。iIELs主要位于小肠绒毛柱状上皮内,为一类组织松散的浸润性淋巴细胞。iIELs由于数量众多并在粘膜免疫防御中具有重要作用,因而成为IELs研究的热点之一。iIELs的表型和功能呈现多样性,依据表面TCR组成的不同分为αβ T细胞和γδ T细胞。前者具有显著的细胞毒活性,因而参与小肠粘膜的免疫应答反应；后者的功能尚未完全明确,但已有的研究显示该细胞功能具有多样性,包括免疫防御、细胞毒活性等。而最近更多的研究显示,γδT细胞具有免疫调节潜能。因此,本文将针对这一科学问题展开相关研究。

本研究旨在验证人外周血单个核细胞(Peripheral blood monouclear cells, PBMCs)来源的Vδ1T细胞以及小鼠iIELs来源的γδ T细胞是否具有免疫调节功能。根据以上研究内容,本论文分为两部分。第一部分通过在有或无外源性转化生长因子β1(TGF-β1)的情况下,检测抗TCR LY294002 Vδ1单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb)扩增的、人PBMCs来源的V81T细胞内Foxp3的表达情况。结果显示,即使无外源性TGF-β1,抗TCR Vδ1mAb亦可扩增获得大量Foxp3+V81T细胞,且Foxp3分子在V81T细胞中稳定表达。应用酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent

assay, ELISA)检测抗TCR Vδ1mAb扩增的PBMCs上清中是否存在TGF-β1。结果显示,培养上清中存在较高水平的TGF-β1。应用流式细胞技术(Fluorescence-activated cell sorting, FACS)检测发现V81T细胞是TGF-β1的主要来源细胞,且V81T细胞表达较高水平的TGF-β1受体(CD105)。接下来我们检测了Foxp3+Vδ1T细胞所表达的其它Treg细胞相关的表面标志物和细胞因子。结果显示,V81T细胞可表达GITR、CTLA-4、CD25等Treg细胞常见的表面分子和白介素-10(interleukin-10, IL-10)、TGF-β1。最后我们应用CFSE方法检测发现, CD25high V51T细胞对CD4+T细胞的增殖具有显著的抑制作用。以上研究结果提示,Foxp3+Vδ1T细胞是一种Treg细胞。这为某些肠上皮的炎症性疾病的发病和治疗、移植免疫免疫耐受机制的研究奠定了基础。 本论文的第二部分通过分离获得C57BL/6J小鼠的iIELs,经TGF-β1和γδTCR抗体(antibody, Ab)共同作用后,应用流式细胞技术检测γδ 确认细节 T细胞内Foxp3分子的表达情况。结果显示,TGF-β1和γδ TCR抗体可以共同诱导Foxp3+γδ T细胞的产生。同时,我们应用CFSE染色的方法检测发现,Foxp3+γδ T细胞对CD4+T细胞的增殖具有显著的抑制作用。以上结果表明,TGF-β1和γδ TCR抗体在体外能够共同诱导小鼠的iIELs产生Foxp3+γδ T细胞,并且该细胞具有免疫调节功能。这为阐明TGF-β1在小肠上皮免疫调节性γδ T细胞产生中的作用,以及某些小肠自身免疫性疾病的发病机制和治疗提供了线索。
尽管心血管疾病的治疗方法现已取得了很大的进展,但是各种心脏疾病导致的心力衰竭在全球仍然具有很高的发病率和死亡率。心力衰竭是一种由多因素引起的疾病,内在的分子机制还不是很清楚,但很可能与潜在的基因和蛋白质表达改变有关。本研究室前期通过对终末期心力衰竭患者心肌组织的基因组学筛选发现转化生长因子结合蛋白2(Latent TGF-β binding protein2, LTBP-2)表达显著升高(7.

43%,与对照比较有统计学意义;IgM的阳性率2.86%;与对照比较,无统计学意义。②ICVD患者CPn DNA的阳性率为81.08%,显著高于对照组。③当血浆标本按1:500稀释后,仍可检测到CPn0308的抗体。当用结合GST-CPn 0308的凝胶微粒(Beads)预吸附可中断反应,而用GST-CPn0186 Beads预吸附则不能中断反应,说明反应的特异性。 因为 结论:①ICVD患者CPn IgG的阳性率明显升高。②ICVD患者PBMC中CPnDNA阳性率显著升高;检出率高于EIA法,是一种敏感的检测CPn感染的检测方法。③初步分析显示CPn0308在感染人群中具有一定的免疫原性。
肝脏缺血再灌注损伤是肝脏移植中常见的问题之一,缺血再灌注引起的肝脏损伤是一个连续不断的过程,并最终导致肝细胞损伤。这个过程是在肝脏短暂缺氧并再氧合时触发,临床上许多情况下可发生肝脏缺血再灌注,例如肝脏低灌流状态,各种各样的外科手术操作,以及移植中的供体器官切取。实际上肝脏缺血再灌注损伤是抗原成分获取的结果,是影响肝脏移植结果的重要因素,引起10%左右的早期移植后器官功能衰竭,并且急性和慢性排异的发生率较高。此外,由于边缘性供体对于缺血再灌注损伤非常敏感,这加剧了供体器官的短缺。因此减少缺血再灌注损伤能明显增加获得手术成功的病人数量。然而,到目前为止仍没有可以预防缺血再灌注损伤的有效方法。所以,为了保护细胞和器官的功能,需要通过广泛的研究更好的了解肝脏缺血再灌注损伤的机制以及寻找合适的干预方法必要的。

selleck产品 青藤碱是从防己科防己属植物青风藤Sinomenium acutum Rehd.et Wils.根茎中分离出的主要活性成分,其结构类似于吗啡,分子式为C_(19)H_(23)NO_4,分子量为329.38,具有镇痛,抗炎等作用,临床主要用于类风湿病的治疗,疗效确切。国内外的研究表明,青藤碱具有良好的抗炎、免疫抑制作用。但是在缺血再灌注损伤中的作用却未见报道。本课题应用“二袖套”法建立大鼠原位肝移植模型,研究青藤碱在肝脏缺血再灌注损伤中的保护作用,并对其作用机制进行探讨。 第一部分:青藤碱对大鼠原位肝移植缺血再灌注损伤的保护作用 目的:探讨青藤碱对大鼠原位肝移植缺血再灌注损伤的保护作用。方法:应用SD大鼠为模型动物;采用Kamada’s“二袖套法”建立SD→SD大鼠原位肝移植模型,大鼠196只随机分为假手术组、生理盐水对照组、低剂量(40mg/kg)和高剂量青藤碱治疗组(80mg/kg),将供肝在4℃林格液中保存5h后植入受体,分别观察移植术后1周存活率,检测移植术后2,6,12,24h血清ALT、AST,TUNEL法检测肝细胞凋亡指数(AI),RT-PCR检测肝脏组织中的TNF-α、IL-β、ICAM-1mRNA的含量,ELISA检测血清IL-2含量,并观察移植肝脏病理形态学的改变。结果:与对照组比较,青藤碱低剂量、高剂量治疗组术后1周存活率显著提高(75%,75%vs12.5%,P＜0.01),在各个时间点,青藤碱治疗组的ALT、AST水平明显低于生理盐水对照组(P＜0.01),肝组织中的TNF-α、IL-1β、ICAM-1mRNA表达与对照组相比均显著减少(P＜0.01),肝细胞凋亡指数下降,在肝移植术后24小时,生理盐水对照组的AI为37.0±4.30,而在青藤碱两治疗组分别为23.8±3.27、18.6±3.03,与对照组相比有显著差异(P＜0.01)。血清IL-2含量降低,肝细胞和肝窦内皮细胞形态也明显改善。

结论:青藤碱可以通过抑制Kupffer细胞激活及释放TNF-α、IL-1β等炎症性细胞因子及ICAM-1等粘附分子,抑制肝细胞凋亡,减少细胞免疫相关IL-2的分泌,减轻肝细胞及肝窦内皮细胞的损伤,达到保护肝移植缺血再灌注损伤的效果。 有 第二部分青藤碱对大鼠肝移植缺血再灌注后TLR4、MAPKs和NF-κB表达的影响 目的:通过观察不同剂量的青藤碱对大鼠肝移植术后TLR4、MAPKs和NF-κB的影响,探讨青藤碱保护大鼠肝移植缺血再灌注损伤的机制。方法:应用“二袖套法”建立SD→SD大鼠原位肝移植模型,大鼠196只随机分为假手术组、对照组、低剂量(40mg/kg)和高剂量青藤碱治疗组(80mg/kg),将供肝在4℃林格液中保存5h后植入受体,选择缺血再灌注后大鼠肝功能损伤最严重的术后6小时为观察点。采用Western Blot方法检测大鼠肝脏组织的TLR4、磷酸化JNK、ERK、p38 MAPK和NF-κB蛋白表达的变化情况。结果:在假手术组TLR4呈低表达,生理盐水对照组TLR4呈高表达,青藤碱显著降低了肝组织TLR4的表达(P＜0.01)。磷酸化JNK、ERK在各组的表达比较无明显差异。磷酸化p38 MAPK和NF-κB在假手术组呈低表达,在生理盐水对照组高表达,而青藤碱明显抑制了磷酸化p38 MAPK和NF-κB的表达(P＜0.

免疫荧光染色法检测P38活化后的核转位过程。 3.免疫蛋白印迹法检测P38、磷酸化P38蛋白的表达水平。 4.应用SPSS15.0统计学软件对实验数据进行统计学分析。 结果 1.免疫荧光染色结果 1.1给予TGF-β1受体（I和II）阻滞剂（LY364947）后绒癌JEG-3细胞中P38的活化及核转位的情况 免疫荧光染色法实验表明，TGF-β1受体阻滞剂作用于绒癌JEG-3细胞后，磷酸化P38在细胞核内的荧光染色强度减弱，与TGF-β1刺激组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）；磷酸化P38的核染色强度呈现浓度依赖效应，随着TGF-β1受体阻滞剂浓度的增加，磷酸化P38在细胞核内的荧光染色强度逐渐减弱（P＜0.05）。 AG14699 1.2给予P38MAPK抑制因子（SB203580）后绒癌JEG-3细胞中P38的活化及核转位的情况 免疫荧光染色法实验表明，P38抑制因子作用于绒癌JEG-3细胞后，磷酸化P38在细胞核内的荧光染色强度减弱，与TGF-β1刺激组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）；磷酸化P38的核染色强度呈现一定的浓度效应，随着P38抑制因子浓度的增加，磷酸化P38在细胞核内的荧光染色强度逐渐减弱（P＜0.05）。

2. Western blotting检测结果 2.1TGF-β1受体（I和II）阻滞剂（LY364947）对绒癌JEG-3细胞中P38及磷酸化P38蛋白水平表达的影响 实验表明，TGF-β1作用于绒癌JEG-3细胞后，P38及磷酸化P38的蛋白表达量显著增高，与空白对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）；而加入TGF-β1受体阻滞剂后，绒癌JEG-3细胞中P38及磷酸化P38的蛋白表达量减少，与TGF-β1刺激组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）；且呈现出浓度依赖效应，随TGF-β1受体阻滞剂作用浓度的增加，P38及磷酸化P38的蛋白表达量逐渐减少。 2.2P38MAPK抑制因子（SB203580）对绒癌JEG-3细胞中P38及磷酸化P38蛋白水平表达的影响 实验表明，P38抑制因子（SB203580）作用于绒癌JEG-3细胞后，P38及磷酸化P38的蛋白表达量减少，与TGF-β1刺激组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）；且表现出浓度依赖效应，P38及磷酸化P38的蛋白表达量随P38抑制因子作用浓度的增加而逐渐减少。 结论： 1.外源性TGF-β1可促进绒癌JEG-3细胞中P38活化后的核转位，并且可提高绒癌JEG-3细胞中P38及磷酸化P38的蛋白水平的表达。

一般 2. TGF-β1受体（I和II）阻滞剂（LY364947）可减弱绒癌JEG-3细胞中P38活化后的核转位，并且降低绒癌JEG-3细胞中P38及磷酸化P38蛋白水平的表达，且呈现良好的浓度依赖效应。 3. P38抑制因子（SB203580）可减弱绒癌JEG-3细胞中P38活化后的核转位，并且降低绒癌JEG-3细胞中P38及磷酸化P38蛋白水平的表达，且表现出良好的浓度依赖效应。 4. TGF-β1信号转导通路与P38MAPK信号转导通路在绒癌JEG-3细胞的恶性侵袭机制中存在着相互作用。
背景： 骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins，BMPs)属于转化生长因子（TGF-β）家族成员，是一组能广泛参与调节多种细胞的增殖、分化和凋亡的功能蛋白，在肿瘤的增殖、侵袭和转移中起重要作用。 骨形态发生蛋白（BMPs）在肝癌的发生、发展中扮演着重要的角色。此前，课题组已对BMPs众多亚型在肝癌细胞中的表达及功能和相关机制做了一系列的研究:发现BMP-2、3、4、5、6、7及BMPR-II在肝癌中均有不成程度表达，并发现BMP-2、6，尤其是BMP-2呈高表达，并且能够显著促进肝癌细胞的侵袭。BMPs发挥其作用需通过其受体实现，但其受体（BMPR）在肝癌中的作用及其介导肝癌侵袭增殖的具体的机制尚不清楚。最近研究表明骨形态发生蛋白受体II(BMPR-II)是BMPs信号传导途径的关键调控因子，据此我们推测BMPR-II对肝癌细胞增殖和侵袭可能有重要的作用。

肿瘤微环境在肿瘤的发生发展过程中占有重要的地位，肿瘤微血管生成与肿瘤的侵袭增殖密切相关，血管生成因子是调控和促进肿瘤血管生成的关键因素。VEGF-C作为主要的血管生成因子，可选择性地诱导淋巴管的增生,介导肿瘤的血管生成和淋巴管的生长，与肿瘤侵袭和转移密切相关。BMPs可诱导各种血管活性因子形成并刺激内皮细胞的迁移和新生血管的形成，我们的前期研究显示血管生成因子MMP-2、MMP-9和E-钙粘蛋白在肝癌中呈不同程度的表达。 BMPR-II的许多生理功能是通过信号通路途径实现。其中丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是细胞内重要的信号转导系统，我们的前期研究显示ERK1/2对BMP-2具有调节作用。但是BMPs信号通路除了包括ERK1/2信号通路，还包括P38和JNK信号通路。其具体的调控机制有待探究。 本研究拟在前期工作的基础上，采用细胞水平小片段RNA干扰技术沉默BMPR-II基因，探讨BMPR-II对肝癌细胞增殖和侵袭的作用及并深层次分析研究BMPR-II参与调控所涉及到的相关信号传导途径及血管形成机制。本研究以BMPR-II为切入点，揭示肝癌细胞增殖和侵袭的发生的分子机制；以VEGF-C为目的，进一步细化肝癌侵袭增殖的血管侵犯机制；以信号通路为联系，阐明肝癌侵袭增殖的调控机制。为肝癌的临床治疗探寻新的治疗靶点和思路。 还有 目的： RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)抑制骨形态发生蛋白受体II(bone mor-phogenetic protein receptor，BMPR-II)的表达，观察抑制BMPR-II后对人肝癌细胞侵袭、增殖、凋亡和周期的影响及对VEGF-C相关的信号通路的影响。 方法： 1.通过半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白印迹（Western Blot）技术从肝癌细胞株HepG2、SMMC7721和Hep3B中筛选BMPR-II基因高表达细胞株。 2.设计并化学合成针对BMPR-II的3对小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，采用阳离子脂质体法瞬间转染。采用离体培养肝癌细胞，并设NormalControl组、 Blank Control组、 Negative Control组及siRNA-BMPR-II-a、siRNA-BMPR-II-b、siRNA-BMPR-II-c转染组。 3.通过半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹（Western Blot）法检测各组细胞中BMPR-II在mRNA和蛋白水平表达的变化，筛选沉默效果最佳序列。 4.运用MTT比色法及Transwell侵袭实验检测转染后细胞增殖及侵袭的变化。流式细胞术检测转染后细胞凋亡和周期的变化。 5.

2ml加入上室,下室加入含有10ng／ml HGF的10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)培养基0.5 ml,37℃,5%CO2培养箱孵育6h,擦净小室上面的细胞,用甲醇／冰醋酸固定30min,Giemsa染色,光镜下计数细胞。 4、Matrigel小室测定细胞侵袭能力 Transwell小室涂布Matrigel基质胶,细胞密度为1×105／ml的细胞悬液0.2ml加入上室,下室加入含有10ng/ml HGF的10%FBS培养基0.5 ml,37℃,5%CO2培养箱孵育24h,擦净小室上面的细胞,用甲醇／冰醋酸固定30min, Giemsa染色,光镜下计数细胞。 5、免疫组化检测TRPC6在PC、BPH组织中的表达 采用链霉素抗生物素蛋白氧化物酶免疫组化法(streptavidin-peroxidase conjugated method, SP法),标本石蜡切片,TRPC6一抗体孵育,4℃过夜,磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)缓冲液代替一抗为阴性对照。以棕黄色颗粒着色,膜着色清楚、连续且明显高于背景为阳性。结果判定：每张切片随机选取5个视野,按阳性细胞所占细胞数量百分比分为5级：阳性细胞数1%-10%为0,1%～5%为1级,5%～10%为2级,10%～0%为3级,20%～50%为4级,>50%为5级。

6、RT-PCR检测TRPC6 mRNA的表达 收集Du145、22Rvl、PC3细胞,采用Trizol试剂提取总RNA,检测纯度及含量,反转录成cDNA,以TRPC6基因引物进行PCR扩增,以β-actin为内参照,条带进行灰度值分析。 Sorafenib半抑制浓度 7、Western blot检测NK4、c-Met、p-c-Met、Akt1/2、p-Akt1/2、ERK1、p-ERK1、β-actin、TRPC6蛋白的表达 收集细胞提取总蛋白,BCA法检测蛋白质含量。进行SDS-PAGE电泳,转印至PVDF膜。封闭,NK4、c-Met、p-c-Met、Akt1/2、p-Akt1/2、ERK1、p-ERK1、TRPC6、β-actin一抗孵育过夜,相应的二抗孵育,增强型化学发光(enhance chemiluminescence, ECL),拍照,以β-actin为内参照,条带进行灰度值分析。 8、TRPC6 siRNA及干扰效率检测 TRPC6 siRNA的设计,合成3对siRNA,使用荧光标记质粒FAM-siRNA检测转染效率,根据筛选出的最佳条件进行RNA干扰,Western blot筛选干扰效率。 9、钙成像 细胞数约为1×105／ml播种在共聚焦皿,5μM

Fura 2-AM37℃孵育,再用HEPESbuffer saline孵育1h,在检测过程中用OAG刺激,用荧光倒置显微镜检测并记录[Ca2+]i变化。 10、流式细胞仪检测细胞周期 制成1×107／ml细胞悬液,95%乙醇固定30min,PBS冲洗后用RNase处理15min,用碘化丙啶(propidium Capmatinib体外 iodide, PI)染液作用细胞30min,流式细胞仪检测细胞周期分布。 11、统计学分析 采用SPSS11.5统计软件包对数据进行统计分析,数据结果以x±s表示,以P
目的 本研究以探讨结肠癌细胞在c-Met信号通路传导途径以及相关机制,为揭示肿瘤侵袭和转移的本质并为抗肿瘤的靶向治疗药物的临床应用提供理论依据。选用的c-Met特异性小分子抑制剂SU11274,探讨其对结肠癌细胞周期变化、增殖抑制作用机制及如何降低HGF刺激引起的c-Met磷酸化以及下游信号Ras及P13 K途径中关键分子Er、AkT、mTor和rpS6蛋白磷酸化水平,进而阻断其介导的细胞效应,从而发挥抑制c-Met激酶的作用。 方法 第一章节以33例结肠癌病理组织为研究对象,就c-Met在结肠癌相关的表达,对c-Met对结肠癌组织的作用以及其下游信号传导通路的表达,并应用免疫组化SP法对33例结肠癌组织进行c-Met及下游通路Er、Akt rpS6及mTor蛋白定位研究,进一步探讨c-Met信号及其下游传导信号在结肠癌组织的高表达及生物学意义。 第二、三章节选用c-Met特异性小分子抑制剂SU1 1274为研究体系,分别将结肠癌细胞株k-ras野生型HT-29、Hct-8及k-ras突变型Hct-116、DLD-1作为研究对象,采用免疫印记、细胞增殖率、流式三种方法,观察选择性C-Met磷酸化抑制剂SU11274对体外培养的HT-29、Hct-8、Hct-116、DLD-1细胞增殖与周期变化的影响,检测了Met及下游Erk、Akt rpS6及mTor信号通路相关蛋白磷酸化水平变化,探讨选择性c-Met磷酸化抑制剂SU11274抗结肠癌细胞内信号传导机制及作用。

Selleck ALK inhibitor 本文第四章节联合应用c-Met磷酸化抑制剂SU 11274及Erk磷酸化抑制剂PD98059,以结肠癌细胞株中k-ras基因突变型Hct-116、DLD-1作为研究对象,采用免疫印记、细胞增殖率、流式三种方法,观察体外培养的k-ras基因突变型Hct-116、DLD-1细胞增殖与细胞周期的影响,检测了Met及下游Erk、Akt rpS6及mTor信号通路相关蛋白的变化,探讨联合用药抗结肠癌细胞内信号传导机制及作用。 结果 肿瘤组织免疫组化结果显示：c-Met在大肠癌中的阳性表达率为36.3%；Akt总阳性表达率为51.5%与c-Met共同出现阳性表达为11例其阳性表达率为91.7%; mTOR总阳性表达率为60.6%与c-Met共同出现阳性表达为10例其阳性表达率为83.3%；rpS6总阳性表达率为57.6%与c-Met共同出现阳性表达为11例其阳性表达率为91.7%；Erk总阳性表达率为51.5%与c-Met共同出现阳性表达为11例其阳性表达率为91.7%。 SU11274对HT-29、HCT-8、Hct-116、DLD-1细胞增殖的抑制作用的结果发现,不同浓度的SU11274均对体外培养的HT-29、HCT-8、Hct-116、DLD-1四细胞系细胞有明显的增殖抑制作用,且这种作用有明显的剂量依赖性和时间依赖性,表现为细胞生长减慢和细胞集落形成率减少,即在浓度范围内,SU11274浓度越高,这种作用越明显。 蛋白免疫印记结果表明：结肠癌细胞HT-29、Hct-8、Hct-116、DLD-1在刺激因子HGF作用下Met、Akt.

25±0.08 pmol/mg；与IR组比较,MC组明显降低移植心AI[3h:(8.65±2.01)％vs.(19.28±4.94)％,P<0.01；24h:(5.82±2.36)％vs.(10.54±3.66)％,P<0.05].激活Akt蛋白(3h:P<0.01；24h:P0.05)。 结论诱导受体产生CO能明显抑制冷缺血再灌注诱导的移植心的细胞凋亡,其机理可能与通过P13K/Akt信号途径对凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax的调节有关。 第四部分 诱导受体产生一氧化碳减轻同种移植心排斥反应不依赖于Foxp3表达的上调 目的CO由于具有强大的干扰体内氧运输的特性而通常被认为是一种有害的废弃物。事实上,低浓度的CO通过调节血管张力、抗炎、抗凋亡等作用缓解移植物缺血再灌注损伤。本研究在小鼠心脏移植的基础上,观察诱导受体小鼠产生CO对同种移植排斥反应和移植心存活时间的影响,并探讨其可能的机制。 方法建立小鼠颈部异位心脏移植模型(C57BL/6→Balb/c小鼠)。受体小鼠自移植前1d至移植后第6d(MC1w组,n=11)或至第13d(MC2w组,n=10)以含二氯甲烷(MC)100mg/kg体重灌胃,或以同体积不含MC的橄榄油灌胃(Tx组,n=6)。观测移植心存活时间,并于移植后6d、10d分别检测受体血清TNF-α、IL-10的含量、心脏移植物和受体脾脏TNF-α、IL-10、Foxp3 mRNA及Foxp3蛋白的表达、心脏移植物ICAM-1(细胞间粘附分子-1)及Caspase-3蛋白的表达；观察移植后6d、10d或移植物心跳停止时移植心胶原纤维增生程度及组织病理学变化。

结果受体以MC灌胃后血液中COHb浓度在3h达到峰值,为(5.24±0.45)%；受体诱导CO可以明显延长移植心存活时间[Tx:(6.33±0.56)d; MC1w: (12.14±0.87)d, P<0.01vs.Tx)及Caspase-3的表达(MC1w组：P0.05)。 结论受体小鼠诱导CO明显减轻同种移植排斥反应并延长移植心的存活时间,其主要机制与可能与CO的抗炎症和抗凋亡功能密切相关,而并不依赖于移植物和受体脾脏内Foxp3表达的上调。
活化淋巴细胞来源DNA 也许 (ALD-DNA)诱导系统性红斑狼疮(SLE)的新机制：巨噬细胞极化及其作用 购买SCR7 系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一个潜在的致死性疾病,以出现各种典型的自身免疫症状包括自身免疫反应、血管炎、关节炎和肾小球肾炎等为特征。在美国SLE病人总数已经超过二十五万,90%发生于育龄期妇女,严重影响人类健康。随着治疗手段的进步,狼疮性肾炎病人5年的生存率从二十世纪五十年代的44%提高到现在的82%,但是SLE病人的平均寿命只有44岁。SLE以其复杂多变的症状引起临床工作者的广泛关注,而SLE几乎累及免疫系统的各个成份,更是引起了免疫学工作者极大的兴趣,针对SLE的发病机制和SLE防治方法的研究一直是科学家关注的重大前沿课题。

作为SLE病人血清学特征的抗双链DNA (double-stranded DNA, dsDNA)抗体,已经被证明是致病性的,可以引起免疫复合物沉积和组织损伤,与SLE疾病的严重程度密切相关。SLE病人遗传学的研究发现抗dsDNA自身抗体大多属于对dsDNA具有高亲和力的IgG亚类,不同于体细胞突变产生的抗体。研究显示自身DNA可以诱导抗dsDNA抗体产生。一般情况下,哺乳动物的DNA免疫原性较弱,不会引起免疫应答。寻找引起自身免疫反应和抗dsDNA抗体产生的驱动成份是免疫学家关注的热点。我们实验室在寻找SLE驱动原的过程中发现用活化淋巴细胞来源的DNA (activated lymphocyte-derived DNA, ALD-DNA)免疫同系的雌性BALB/c小鼠,可以产生一系列的SLE症状,包括高水平的抗dsDNA自身抗体、蛋白尿、免疫复合物沉积和肾小球肾炎,这些症状模拟病人体内由大量凋亡细胞来源的自身DNA引起的SLE症状,因此ALD-DNA免疫的小鼠可以被作为理想的小鼠狼疮模型进行探讨SLE疾病可能的细胞与分子免疫学机制。 selleck激酶抑制剂 SLE通常被认为是由自身抗体介导的全身性炎症反应和由T／B细胞介导的适应性免疫应答所诱发的组织损伤,但是SLE发病和疾病进展的细胞与分子机制仍不清楚。有研究提示,在SLE小鼠中,显著激活的巨噬细胞和其它髓系细胞大量浸润到淋巴组织和肾脏中,启动和促进适应性免疫应答,从而导致SLE的发生。越来越多的证据显示F4／80+巨噬细胞是SLE肾炎中主要的浸润细胞,在SLE肾炎的发生过程中扮演重要角色,而浸润的巨噬细胞发挥保护性还是病理性作用有待阐明。功能上的可塑性和多样性是单核巨噬细胞的显著特点之一,巨噬细胞随着周围环境的变化,功能上会发生显著变化,这些功能上的变化,也称为功能上的巨噬细胞极化,可以产生有不同基因表达谱和不同功能的巨噬细胞亚群。目前认为M1和M2(包括M2a、M2b和M2c)是单核巨噬细胞功能上连续变化过程的两个极端。在SLE疾病过程中巨噬细胞是否发生极化、极化类型及其机制鲜有报道。 本研究的目的在于：(1)探讨巨噬细胞在ALD-DNA诱导SLE发病中的作用；(2)通过表型分析和细胞因子表达谱鉴定,分析SLE模型鼠肾炎组织中巨噬细胞的活化和极化类型以及可能的分子机制；(3)研究导致自身DNA清除障碍和打破免疫耐受引起巨噬细胞产生免疫应答的机制；(4)设计体内外实验探索SLE疾病可能的防治方法。我们的研究分为以下四部分：

1.巨噬细胞在ALD-DNA诱导SLE发病中的作用 体内未被清除的凋亡细胞来源的自身DNA具有免疫原性,可以引发一系列的免疫应答,从而导致抗自身DNA的抗体产生和抗体介导的组织损伤,这在SLE病人体内非常普遍,但是巨噬细胞是否在SLE发病过程中发挥作用仍不清楚。在本课题中,我们在ALD-DNA免疫的SLE小鼠模型中,发现狼疮肾炎组织中有大量的活化巨噬细胞浸润。ALD-DNA可以在体内和体外诱导巨噬细胞分泌细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10,并上调表达表面活化标志包括MHC class-Ⅱ、CD40、CD80和CD86,但是非活化淋巴细胞来源的DNA (unactivated lymphocyte-derived DNA, UnALD-DNA)并不能引起巨噬细胞的活化。我们进一步发现活化的巨噬细胞在体外可以促进T分泌IL-4和IL-10,促进B细胞产生抗dsDNA的自身抗体,从而参与ALD-DNA诱导的自身免疫反应。更重要的是去除SLE模型小鼠体内的巨噬细胞可以有效减轻尿蛋白水平、缓解狼疮性肾炎的症状。这些研究结果提示巨噬细胞在SLE发病过程中扮演重要角色,ALD-DNA通过诱导巨噬细胞活化进而启动针对自身抗原的固有免疫和适应性免疫应答,从而造成免疫复合物沉积和组织损伤。以上发现为SLE的发病机制提供了新视野,为临床SLE疾病的治疗提供了以控制巨噬细胞浸润和活化作为靶点的可能的新治疗策略。 2.

5μmol/L姜黄素)和对照组(正常台氏液培养120min代替模拟I/R),采用流式细胞术检测细胞凋亡情况,采用Western blot检测GSK-3、酪氨酸磷酸化GSK-3(pTyr-GSK-3)和丝氨酸磷酸化GSK-3(pSer-GSK-3)蛋白的表达。结果与对照组比较,模型组H9c2细胞凋亡率明显提高(t=10.439,P=0.000),模型组pTyr-GSK-3和pSer-GSK-3表达均显著增加(t=5.208,P=0.006;t=5.854,P=0.004)。与模型组比较,姜黄素组凋亡率及pTyr-GSK-3表达水平显著降低(t=-8.325,P=0.001;t=-3.607,P=0.023),存活率及pSer-GSK-3表达水平显著升高(t=9.165,P=0.001;t=3.747,P=0.02)。结论

GSK-3的酪氨酸和丝氨酸磷酸化可能参与心肌细胞I/R损伤,姜黄素减少I/R心肌细胞凋亡可能与其通过减少酪氨酸磷酸化、增加丝氨酸磷酸化抑制GSK-3活性有关。
锂剂是Mg2+的竞争性抑制剂,具有抗躁狂、抗抑郁、抗自杀的临床效果。锂剂有众多的直接目标分子,其中,锂剂通过抑制糖原合成酶激酶-3(GSK-3)发挥稳定情绪、改善行为、促进神经生长等作用。已有多项研究报道GSK-3参与神经变性性疾病、脑血管性疾病、神经系统肿瘤等疾病的发生,本文就GSK-3、锂剂和神经精神性疾病作一综述。
LPS刺激巨噬细胞产生IFN-β在抵御外来病原微生物的免疫反应中发挥重要作用。本研究探讨新抗生素S632A3促进LPS诱导巨噬细胞产生IFN-β及其分子机制。采用实时定量PCR检测mRNA含量,ELISA检测细胞因子含量,激酶分析检测GSK-3β活性,Western Depsipeptide分子量 blotting检测蛋白磷酸化水平。结果表明:S632A3可显著促进LPS诱导的巨噬细胞产生IFN-β,其分子机制是抑制细胞内GSK-3β活性,降低转录因子c-Jun苏氨酸239位点的磷酸化并增加c-Jun稳定性。结果提示,S632A3是一个新的抗炎先导化合物,通过抑制GSK-3β活性促进LPS诱导巨噬细胞产生IFN-β。
Irradiation from diverse sources is ubiquitous and closely associated with human activities. Radiation therapy (RT), an important component of multiple radiation origins, is a common therapeutic modality for cancer. More importantly, RT provides significant

contribution to oncotherapy by killing tumor cells. However, during the course of therapy, irradiation of normal tissues can

result in a wide range of side effects, including self-limited acute toxicities, mild chronic symptoms, or severe organ dysfunction. 时间 Although numerous promising radioprotective agents have emerged, only a few have successfully entered the market because of various limitations. At present, the widely accepted hypothesis for protection against radiation-caused injury involves the Wnt canonical pathway. Activating the Wnt/β-catenin signaling pathway may protect the salivary gland, 那个 oral mucosa, and gastrointestinal epithelium from radiation damage. The underlying mechanisms include inhibiting apoptosis and preserving normal tissue functions. However, aberrant Wnt signaling underlies a wide range of pathologies in humans, and its various components contribute to cancer. Moreover, studies have suggested that Wnt/ β-catenin signaling may lead to radioresistance of cancer stem cell. These facts markedly complicate any definition of the exact function of the Wnt pathway.
目的探讨Tau蛋白调控Fyn信号通路在阿尔茨海默病(AD)大鼠发病中的作用机制。方法雄性SD大鼠60只随机分为正常组,模型组及观察组。采用β淀粉样蛋白毒性片段(Aβ25～35)海马注射制备AD大鼠模型。10μmol/L SB216763(Tau蛋白抑制剂)注射至观察组大鼠脑组织。采用SABC法对大鼠脑组织中Tau蛋白进行免疫组化检测,Western印迹检测Fyn和Fak的表达。结果与正常组相比,模型组大鼠脑组织Tau蛋白含量及Fyn和Fak的表达显著增加(P<0.

9%、13.8%及23.9%。BMI越高,年龄越大糖尿病、高血压患病的相对危险度越高。 (二) 动物模型研究: 1. MS组体重、Lee’s指数和腹围显著高于对照组,表现出腹型肥胖体型。 2. MS组大鼠的WAT重量、VAT总量及其内脏脂肪系数均显著高于对照组,各部位WAT细胞的面积、大脂肪细胞数量均明显高于对照组。 3. MS组大鼠血压、FINS、LDL和TG、FFA均明显高于对照组。 病理切片可见,MS组大鼠BAT结构松散;棕色脂肪细胞内脂滴增大、增多。肝组织,部分肝细胞脂肪变性,肝板结构消失。

(三) 分子生物学实验: 1. MS肥胖大鼠脂肪组织中AGT mRNA的表达:皮下脂肪组织(Sub)中AGT mRNA的表达明显低于对照组,而BAT、VAT中AGT mRNA的表达均显著高于对照组。 2. MS肥胖大鼠脂肪组织中肾素mRNA的表达:BAT中mRNA的表达明显低于对照组而Sub中mRNA的表达显著高于对照组,VAT中与对照组无显著性差异。 3. MS肥胖大鼠脂肪组织中ACE mRNA的表达:在Sub中表达明显低于对照组,而BAT和VAT中ACE mRNA的表达均显著高于对照组。 4. MS肥胖大鼠脂肪组织中AT1 mRNA和蛋白表达:在BAT中AT1 mRNA和蛋白表达明显低于对照组,VAT中AT1 也许 mRNA和蛋白表达均显著高于对照组,而Sub中AT1 mRNA的表达高于对照组,AT1蛋白的表达与对照组无显著性差异。 5. MS肥胖大鼠脂肪组织中ACE2及AT2 mRNA的表达:在MS肥胖大鼠和对照组大鼠中,各部位脂肪组织均未发现ACE2及AT2 SCR7 mRNA的表达。 6. MS肥胖大鼠脂肪?
从我们的大规模cDNA克隆和测序计划中,利用表达谱基因芯片筛选的结果并通过生物信息学分析,我们选取了2条基因进行进一步的研究,以探讨这些基因的功能。 外界刺激通过细胞内的蛋白激酶反应链,将信号从细胞膜传导到核,导致相关转录因子的磷酸化和被激活,从而引起基因表达的变化。cAMP反应元件结合蛋白(cAMP-responsive element binding protein,CREB)也许是其中最具特点的刺激诱导转录因子我们实验室克隆了一个人类CREB的新基因(CREB4),该基因编码一个395个氨基酸的蛋白,并与小鼠的CREB3高度同源。RT-PCR显示CREB4在胰腺、前列腺、脑和骨骼肌组织中表达,在小肠、外周血白细胞、睾丸和胸腺组织中低表达,而在成人胎盘、心脏、脾脏、卵巢、肾脏、肝脏、肺和结肠组织中未检测到特异性条带,在检测的各肿瘤组织中显示CREB4基因只在结肠癌

(CX-1和GI-112)、肺癌(LX-1)、前列腺癌(PC-3)和胰腺癌(GI-103)有表达,而在乳腺癌(GI-101)、卵巢癌组织(GI-102)和肺癌组织(GI-117)中未测到特异性条带。通过生物信息学将CREB4定位于人染色体1q21.3。表达谱芯片结果显示CREB4基因在肝癌组织上调。GFP荧光定位显示全长CREB4定位与细胞质内,而去C端的突变体定位与细胞核。采用酵母双杂交系统以寻找与CREB4相互作用的蛋白。我们发现CREB4可以与核孔复合物相关蛋白TPR及kayopherinα2相互作用,而这两个蛋白都与蛋白质的核转运有关,推测CREB4可能通过它们进入细胞核。 蛋白4.1是红细胞中以血影蛋白(spectrin)为基础的细胞膜骨架的一个基本成分,在维持红细胞质膜的形态和机械性能方面起着至关重要的作用。我们克隆了一个新的蛋白4.1基因(4.1O)。该基因全长2312bp,编码一个553氨基酸的蛋白。RT-PCR显示4.1O只在

卵巢组织中检测到特异性条带,在胎胸腺组织和胎脑组织中低表达。生物信息学分析显示4.1O含有14个外显子和13个内含子,定位于人染色体9q21-9q22区段上。表达谱芯片结果提示4.1O基因在肝癌组织和胃癌组织中表达上调。
第一部分 Y-27632浓度 榄香烯在喉癌化疗中作用机制的体外研究 目的:探讨榄香烯对人喉鳞癌细胞株 HEp-2 细胞和 AMC-HN-8 细胞的抑制作用; 以及与凋亡相关的 Caspase-3 活性的改变;探讨榄香烯抑制人喉癌细胞株过程中 真核细胞翻译起始因子 eIF 家族成员(eIF4E、eIF4G)与肿瘤新生血管有关的 bFGF、VEGF 的表达情况。方法:使用 MTT 法和流式细胞分析技术(FCM), 研究榄香烯诱导人喉癌细胞株凋亡的作用;并使用比色法,研究榄香烯诱导人喉 鳞癌细胞株凋亡时 Caspase-3 活性的变化;以及使用 Westernblot 和 RT-PCR 法检 测榄香烯作用的人喉癌细胞株中 eIF4E、eIF4G、bFGF、VEGF 在 mRNA 和蛋白 水平的表达。结果:榄香烯抑制人喉癌细胞株 HEp-2 细胞和 AMC-HN-8 细胞有 时间剂量依赖性(HEp-2 细胞 24 小时 IC50值为 69.297μg/ml,AMC-HN-8 细胞 24 小时 IC50值为 70.