成功建立稳定DJ-1核内高表达的HL-60细胞系。 测序结果证实，DJ-1基因的细胞核定位表达质粒pCMV/myc/nuc-EGFP-DJ-1的插入序列与DJ-1全长cDNA的GenBank序列完全一致。荧光显微镜观察高表达组细胞中可见绿色荧光信号。Western blot检测高表达组细胞核内DJ-1蛋白的表达量明显增高，提示成功稳定的DJ-1核内高表达HL-60细胞株。2.DADS对DJ-1细胞核内高表达的HL-60生物学行为的影响。 MTT法显示：DADS作用前，高表达组细胞生长能力明显高于对照组和空载体组细胞（P<0.05）。DADS作用后，三组细胞的增殖能力明显减弱，且高表达组细胞增值抑制率明显低于对照组和空载体组（P<0.05），DADS作用后，三组细胞相对集落形成率均减低（P<0.05），高表达组细胞G1期细胞百分率明显低于对照组和空载体组（P<0.05），提示DJ-1核内高表达可促进HL-60细胞增殖作用。DADS作用后，三组细胞G1期百分率均明显提高（P<0.05），S期均明显降低（P<0.05）；DADS作用后，三组细胞的还原率均明显升高（P<0.05）；DADS作用后，三组细胞迁移能力均明显减弱（P<0.05）；DADS作用后，三组细胞穿膜数明显减少，侵袭能力均明显减弱（P
目的：糖原合成酶激酶3（Glycogen

Sorafenib体内 synthase kinase-3，GSK-3）是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与了细胞增殖、生长及凋亡，调节神经极性和神经稳态，并在神经炎症过程中起重要作用。其亚型GSK-3β已被证实与成瘾药物的行为学效应存在一定的关联，应用GSK-3β抑制剂能够降低氯胺酮的神经毒性及类精神失常作用。但GSK-3β是否参与氯胺酮奖赏和成瘾及其具体作用机制目前仍不明确。本研究通过使用特异性及非特异性的GSK-3β抑制剂对氯胺酮的自身给药及复吸行为进行干预，从而明确GSK-3β在氯胺酮奖赏、奖赏动机以及复吸行为中所起的作用。 实验一：氯胺酮自身给药对脑区GSK-3β表达的影响 方法：成年雄性SD大鼠（n=16）进行颈静脉插管手术，恢复后随机平均分为两组：自身给药组和对照组。自身给药组大鼠用FR1程序进行氯胺酮自身给药的训练及维持，对照组大鼠每天置于自身给药装置中相同的时间但不获得氯胺酮。维持期的最后一天给药结束后两小时对大鼠进行断头取脑，Western Blot检测尾壳核（CPu）、海马（Hip）、伏隔核（NAc）、前额皮层（PFC）及腹侧被盖区（VTA）中磷酸化GSK-3β（p-GSK-3β）及总GSK-3β（t-GSK-3β）的表达。另选两组成年SD大鼠作为氯胺酮急性处理的对照，腹腔注射生理盐水（n=3）或40mg/kg的氯胺酮（n=3）后两小时进行断头取脑，用Western

Blot的方法检测CPu、Hip、NAc、PFC及VTA中p-GSK-3β及t-GSK-3β的表达。 结果：实验结果显示动物在氯胺酮0.5mg/kg/针的剂量下能够维持稳定的自身给药行为。Western B-Raf 抑制剂 drug Blot结果显示大鼠氯胺酮自身给药后，

GSK2656157 花费 CPu (F(2,5)=15.804, p<0.05)中磷酸化GSK-3β占总GSK-3β的比例与对照组和急性处理组相比明显降低（p0.05），但同样降低了累进频率中氯胺酮的给药次数（p<0.05）。氯胺酮引燃的氯胺酮觅药行为测试结果显示使用LiCl后可以显著降低氯胺酮引燃的觅药行为（p<0.05），但其无效鼻触反应也显著减少（p
目的：研究盐霉素对前列腺癌细胞系PC-3在体外的克隆形成能力的影响及其与β-catenin和mTOR信号通路的关系,探讨盐霉素抗前列腺癌干细胞的作用机制。 方法：盐霉素处理呈对数生长的前列腺癌细胞系PC-3,观察其克隆形成变化；采用流式分析仪检测盐霉素处理PC-3后肿瘤干细胞比例的变化；用WesternBlot法检测盐霉素处理后前列腺癌细胞中的β-catenin和mTOR信号通路的蛋白表达变化；实时定量PCR法检测盐霉素处理后前列腺癌细胞中β-catenin信号通路的靶基因表达水平变化；比较ALDHhigh亚群和ALDHlow亚群克隆形成变化；GSK3抑制剂和雷帕霉素分别处理PC-3,观察其对克隆形成能力的影响并检测其肿瘤干细胞比例的变化。 结果：①盐霉素对前列腺癌细胞克隆形成能力的影响：浓度分别为0、0.25uM、0.5uM、luM、2uM和4uM的各处理组的克隆形成数分别为41、39、36、30、18和9。②盐霉素对PC-3中肿瘤干细胞比例的影响：流式细胞仪分析结果显示荧光阴性对照组肿瘤干细胞比例均值为0.05%,空白对照组肿瘤干细胞比例均值为7.40%,盐霉素4uM处理12h组肿瘤干细胞比例均值为1.86%,通过两样本均数t检验,空白对照组与实验组之间差异具有统计学意义(p<0.05)。③盐霉素对不同干细胞亚群细胞增殖能力的影响：ALDHhigh亚群的细胞较ALDHlow亚群具有更强的增殖能力,且盐霉素对前列腺癌干细胞具有选择性杀伤作用,ALDHhigh亚群和ALDHlow亚群的空白组与盐霉素处理组的克隆数分别为20、4、9和5。④盐霉素对PC-3干细胞的β-catenin和mTOR信号通路的影响：克隆形成实验中,空白对照组、盐霉素组、雷帕霉素组和GSK3抑制剂组的克隆数分别为80、51、70和124,流式细胞分析仪检测干细胞比例变化,GSK3抑制剂组高表达ALDH细胞达9.35%,雷帕霉素组中高表达ALDH的比例为1.62%,雷帕霉素+盐霉素组中肿瘤ALDH高表达比例为0.94%,而GSK3抑制剂+盐霉素组的比例为2.95%,差异具有统计学意义(P<0.

875±1.126，P<0.05)；12h（4.375±0.916）较6h有所升高，但仍低于NC组（P<0.05)；24h时评分又出现降低（2.125±0.835，P<0.05)；之后评分逐渐升高，3d神经功能评分（5.75±0.886，P0.05)，6h时稍升高（79.54±0.715, P<0.05)，3d开始下降（82.13±0.593，P<0.05），7天明显下降（81.24±1.010，P<0.05）开始增高，24h（0.909±0.052，P<0.05）达到高峰，随后逐渐降低。p38MAPK在神经元和神经胶质细胞都有表达,尤其在脑室两侧和脉络丛表达明显,在液压冲击脑损伤后随着时间延长其表达逐渐增强，12h（0.400±0.034，P<0.05），24h（0.585±0.026，P<0.05），3天（0.746±0.040，P<0.05），7天（0.917±0.040，P<0.05）。P-p38MAPK则主要表达于细胞核，在正常脑组织中几乎不表达,液压冲击脑损伤后其表达升高，且变化趋势与AQP4变化趋势相似，6-12h（0.292±0.022，0.499±0.019，P<0.05）逐渐升高，24h（0.911±0.049，P<0.05）达高峰，3天后出现下降（0.666±0.037，P<0.05)，7d后明显降低(1.554±0.199)，但仍高于正常(P<0.05)，7d后明显降低(1.673±0.100)，但仍高于正常(P<0.05），7d（2.373±0.064,P<0.05)，7d后降低(0.429±0.088)，仍高于对照组(P<0.05)。各亚组间比较均有差异(P<0.05)。SBI组和SBII组组间比较，仅于12h（4.875±0.835，5.125±0.835）、24h（2.500±0.926，2.75±0.707）、3d（6.125±0.99，6.38±0.744）差别有统计学意义(P<0.05)。与NC组相比，TBI组，SBI组和SBII组除7天（9.000±0.00，8.375±0.744，8.500±0.535，8.625±0.518）外差异有统计学意义(P0.05)；6h时明显低于TBI组，差异有统计学意义(P0.05)，12h时三组间比较均有差异(P<0.05)，脑水含量分别为（81.89±0.58,80.77±0.79,79.48±0.76），24h时脑水含量均达最高，且三组间比较均有差异(P0.05)。

selleck激酶抑制剂 4免疫组化 与TBI组相比，SBI组和SBII组AQP4蛋白表达在1h差异均无统计学意义(P>0.05)，余各时间点均低于TBI组，以12h（0.535±0.027，0.489±0.333，0.583±0.016）、24h（0.856±0.023，0.800±0.038，0.909±0.052）、3d（0.776±0.025，0.708±0.018，0.804±0.016）最为明显(P<0.05)。SBI组和SBII组两组间比较于12h、24h、3d差别有统计学意义(P<0.05)。SBI组和SBII组两组间比较，仅于12h、24h、3d差别有统计学意义(P0.05)外，在其余各时间点SBII组p38MAPK表达都低于SBI组（P0.05)，其他时间点差别均有统计学意义(P<0.05)，但SBI组与SBII组间组间比较，于12h、24h、3d差别均有统计学意义(P0.05)，但TBI组与SB

点击此处 II组、SBII组与SBI组比较差别有统计学意义(P<0.05)，其余各时间点三组间差异均有统计学意义(P0.05)，7d时SBII组与TBI组无差别(P>0.05)，其余各时间点三组间比较均有统计学意义(P
研究目的评估SB203580联合白藜芦醇诱导人类肺腺癌A549细胞凋亡的作用，并探索其具体的分子机制。 研究方法 1.建立稳定的细胞凋亡模型：不同浓度的SB203580（0，1和10μM）和/或白藜芦醇（0，50，75，100和125μM）对A549细胞进行处理，采用CCK-8法检测细胞活力。 2.判断细胞的死亡形式：用Annexin V/PI双染法及PI染色的方法进行流式检测，判断SB203580增强白藜芦醇诱导的A549细胞死亡是否为凋亡。 GABA drugs 3.应用流式细胞仪检测SB203580对白藜芦醇诱导的线粒体膜电位下降的影响情况。 4.免疫荧光法分析Bax、Bak在联合使用SB203580和白藜芦醇时与单独使用白藜芦醇时活化量的区别。 5.荧光底物法检测caspase在联合使用SB203580和白藜芦醇与单独使用白藜芦醇时的激活情况。 6.共聚焦荧光显像检测AIF、Smac从线粒体释放的情况。 7. Western blotting检测外源性途径中FasL的表达情况。 结果 1.不同浓度白藜芦醇可以诱导细胞呈浓度依赖性的活力下降；单加SB203580对细胞的活力没有影响，但与白藜芦醇联合使用可以显著地增加白藜芦醇诱导的细胞毒性的能力，具有统计学意义的75μM白藜芦醇和10μM SB203580被选为后继实验的浓度。 2.多种凋亡检测技术证实，SB203580促进白藜芦醇诱导的细胞死亡其具体方式为细胞凋亡。 3. SB203580增加了白藜芦醇诱导的线粒体膜电位下降； 4. SB203580增加了白藜芦醇诱导的Bax活化量，但是Bak的活化量反而下降。 5. SB203580增加了白藜芦醇诱导的caspase-9的轻微活化和caspase-3的大量活化。 6. SB203580使单加白藜芦醇时没有活化的caspase-8被激活。 7. AIF和Smac在SB203580促进白藜芦醇诱导的细胞凋亡晚期没有从线粒体中释放出来。 8. SB203580增加了白藜芦醇诱导的FasL切割。 结论 1. SB203580增加了白藜芦醇诱导的A549细胞凋亡。 2.

07倍,提示SKBR3/TDR对MK-2206无耐药性。不同浓度的MK-2206与trastuzumab合用后,SKBR3和SKBR3/TDR的IC50均有不同程度的下降,但以SKBR3/TDR的下降更明显,差异具有统计学意义(P0.05)(图7)。提示MK-2206不增加trastuzumab在SKBR3/TDR细胞内的蓄积。3. Western Blot检测结果显示MK-2206可以下调p-PRAS40-Thr246和p-AKT-Thr308蛋白的表达。与对照组相比,不同浓度的MK-2206处理SKBR3/TDR和SKBR3细胞后,均可以下调p-PRAS40-Thr246和p-AKT-Thr308蛋白的表达,且呈剂量依赖性(图8、图9),实验组与对照组之间差异有统计学意义(P<0.01)。这些结果表明了联合应用trastuzumab和MK-2206的有效性。结论通过建立裸鼠HER2阳性乳腺癌模型及相关动物实验,结果提示：拮抗p-PRAS40-Thr246能够减缓裸鼠乳腺肿瘤的生长,对肿瘤生长有明显抑制作用。MK-2206与trastuzumab联合应用可以下调p-PRAS40-Thr246。P-PRAS40-Thr246抑制剂与trastuzumab联合应用,可有效逆转裸鼠乳腺癌trastuzumab耐药。P-PRAS40-Thr246是一个新型的乳腺癌治疗靶点,为逆转trastuzumab耐药的研究提供帮助。
目的：肝细胞肝癌(Hepatocellular

AZD6244临床试验 carcinoma,HCC)是肝脏最常见的恶性肿瘤之一,在男性癌症死亡率中居于第二位。肝脏切除、肝移植、局部消融等治疗方式使肝癌的治愈成为可能,但多数肝癌患者有肝硬化背景,在发现时已经处于病程的中晚期,仅有30%～40%的患者适合该治疗,且其术后5年的复发率高达70%。介入化疗栓塞等只能暂时缓解肝癌患者的临床症状,并不能有效显著改善患者的预后。索拉菲尼(sorafenib),一种多蛋白激酶抑制剂,具有抗血管生成和抑制肿瘤细胞增殖的双重作用,是治疗进展期肝癌的一线用药。但是由于肝癌复杂的生物学特性,通过其内在的或获得的机制造成对索拉菲尼的耐药,导致索拉菲尼治疗进展期肝癌效果极其有限。但索拉菲尼治疗失败后尚无有效的化疗药物可以应用,因此探讨索拉菲尼耐药的机制对于改善进展期肝癌患者的预后显得迫切和重要。在中国,大约75%的肝癌患者患有乙型病毒性肝炎,持续的慢性肝脏损伤刺激星形细胞和成纤维细胞,形成肝脏的纤维化,纤维化最终发展为肝硬化。肝硬化破坏了肝脏正常的血液供应,导致肝脏血流循环减少,形成局部缺氧的微环境；从肝脏一般性腺瘤样增生、不典型腺瘤样增生到早期癌的演变中,细胞的快速增殖也会造成肿瘤局部缺氧。索拉菲尼在抑制肿瘤新生血管生成的同时,又加重了肿瘤内部的缺氧。而肿瘤内部的缺氧微环境(hypoxic

microenvironment)加剧了肿瘤细胞基因的不稳定性并诱导肿瘤多药耐药(multidrug resistance,MDR)相关蛋白的表达,造成肿瘤对化疗和放疗的耐受。缺氧诱导因子(Hypoxia-inducible factor, HIF)是肿瘤缺氧反应中的关键因子,其通过调控肿瘤能量代谢、新生血管形成、增殖、浸润和转移等相关基因的转录和表达,决定着肿瘤的发生发展。因此下调缺氧诱导因子、促进它的降解或抑制它的功能等,都可以阻断缺氧诱导反应,达到抑制肿瘤的效果。HIF是由α亚单位和p亚单位组成的异构二聚体,属于碱性螺旋-环-螺旋-PAS转录因子家族成员。HIF主要包括HIF-1α和HIF-2a,尽管二者有48%的同源氨基酸序列,结构相似,但其不同之处正在不断被发现。HIF-la在急性缺氧环境下被激活并稳定表达,但随着缺氧时间的延长其蛋白表达水平逐渐降低直至消失,相反HIF-2a的含量随着缺氧时间的延长持续增加。缺氧诱导的基因如VEGF在急性缺氧期是HIF-1a的靶基因,而随着缺氧时间的延长主要由HIF-2a激活。与HIF-1a广泛分布不同,HIF-2a仅能在特定细胞如肝细胞内表达。肝细胞内的血管生成素基因主要由HIF-2a调控,而灭活HIF-2a可以抑制VHL相关肝血管瘤的生长。同HIF-1a相比,HIF-2a可能在肝癌发生发展中发挥更加重要作用,是治疗肝癌的一个潜在靶点。就HIF-2a在肝癌发生发展中的作用人们做了初步的探讨,多数研究认为HIF-2a促进肝癌的发生发展,然而也有少数研究提示HIF-2a对肝癌的进展具有负调节作用,表明HIF-2a在肝癌发生发展中的作用存在争议,这从另一方面也反映了HIF-2a在肝癌发生发展中的作用机制是复杂的。研究表明,肿瘤特异性的缺氧微环境可能与索拉菲尼的耐药相关,但其确切的机制尚未完全阐明。因此,我们设计实验研究HIF-2a在肝癌发生发展中的作用,探索缺氧微环境下索拉菲尼的耐药机制,这样不仅可以进一步完善肝癌发生发展分子机制理论,而且有望为提高索拉菲尼治疗肝癌的疗效提供潜在的靶点。方法：1.应用免疫组织化学及免疫印迹方法检测肝癌肿瘤组织、癌旁组织以及肝癌细胞系HepG2、Bel-7402、Huh-7、SMMC-7721中HIF-2a蛋白的表达,分析HIF-2a蛋白表达水平与肝细胞肝癌临床病理特征之间的关系。2.既往的研究表明：缺氧培养的肝癌细胞系同常氧培养相比其索拉菲尼IC50显著增高,提示缺氧增加了肝癌细胞系对索拉菲尼的抵抗。为进一步研究是HIF-1a还是HIF-2a影响了缺氧微环境下肝癌对索拉菲尼的治疗效果,本课题应用Western

GDC941 BYL719临床试验 blot观察索拉菲尼治疗前后肝癌细胞系中HIF-1α、HIF-2a的表达。体外实验和裸鼠成瘤实验观察HIF-2a封闭前后索拉菲尼对肿瘤细胞增殖能力的影响,探讨HIF-2a在索拉菲尼耐药中的作用。3.采用细胞免疫化学和TOP-Flash荧光素酶报告实验观察HIF对Wnt/β-catenin经典信号通路活性的影响。4.采用基因干扰技术检测HIF-2α封闭前后及c-Myc封闭前后Wnt/β-catenin通路中关键蛋白的表达,分析缺氧环境中HIF-2α表达与Wnt/β-catenin信号通路间的关系。Western blot分析肝癌移植瘤模型中对照组、索拉菲尼治疗组、HIF-2α shRNA组及联合组中HIF-2α、Wnt/β-catenin通路中关键基因的表达,深入探讨缺氧微环境中索拉菲尼耐药的分子机制。结果:1. Western blot分析发现,肝癌组织中HIF-2α的蛋白表达水平明显高于癌旁组织中HIF-2a的蛋白表达水平(P<0.05)。与HIF-1α不同,HepG2细胞经索拉菲尼处理后其HIF-2α蛋白的表达量较未处理组增加1.7倍,经统计学检验,具有统计学意义(P<0.

通过测定与分析多种内皮细胞粘附分子和分泌因子的表达水平,包括细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)、血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesionmolecule-1, VCAM-1)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, eNOS)、一氧化氮(nitric oxide, NO)和内皮素-1(endothelin,ET-1),从不同角度了解sPLA2-IIA刺激对血管内皮功能的影响。

2.通过观察4-BPB (4-bromophennacyl bromide, sPLA2-IIA水解作用的抑制剂)对sPLA2-IIA诱导的内皮功能影响的变化,以了解sPLA2-IIA的水解作用是否参与了损伤内皮细胞的过程。 3.通过观察PD98059(ERK选择性抑制剂)、SP600125(JNK选择性抑制剂)、SB203580(p38选择性抑制剂)对sPLA2-IIA诱导的内皮功能影响的变化,以了解MAPKinase信号通路是否参与了sPLA2-IIA对内皮细胞的影响。 KRX-0401订单 4.通过观察Bay11-7085(NF-kB选择性抑制剂)对sPLA2-IIA诱导的内皮功能影响的变化,以了解NF-kB是否参与了sPLA2-IIA对内皮细胞的影响。 研究方法： 1.体外分离培养人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC)。 2.不同浓度的sPLA2-IIA体外刺激HUVEC细胞,设置3个浓度(0.01、0.1、1μ g/ml),以未加任何药物刺激培养的细胞作为空白对照,以10ng/ml 可能 TNF-α刺激培养的细胞作为阳性对照,利用试剂盒检测内皮细胞上清的一氧化氮浓度,并利用荧光定量逆转录多聚酶链反应(Real-Time PCR)方法分析一氧化氮合酶(eNOS)、内皮素-1(endothelin,ET-1)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和血管粘附分子-1(VCAM-1)的mRNA表达水平的变化,用Western Blot法分析eNOS、 ICAM-1、VCAM-1在蛋白水平的表达水平变化,用ELISA方法分析ET-1在蛋白水平的表达变化。

3.采用体外分离培养HUVEC的方法,以1μg/ml sPLA2-IIA、10μmol/L4-BPB单独或联合刺激内皮细胞,利用试剂盒检测内皮细胞上清的一氧化氮浓度,并通过Real-Time PCR检测分析eNOS、ET-1、ICAM-1、VCAM-1转录水平的变化,用Western Blot法分析eNOS、ICAM-1、VCAM-1在蛋白水平的表达变化,用ELISA方法分析ET-1在蛋白水平的表达变化。 4.以1μg/ml sPLA2-IIA.1μmol/LPD98059或SP600125或SB203580单独或联合刺激内皮细胞,利用试剂盒检测内皮细胞上清的一氧化氮浓度,并通过Real-Time PCR检测分析eNOS、ET-1、ICAM-1、VCAM-1转录水平的变化,用Western

Blot法分析eNOS、ICAM-1、VCAM-1在蛋白水平的表达变化,用ELISA方法分析ET-1在蛋白水平的表达变化。 selleck化学药品 5.以1μg/ml sPLA2-IIA、1μmol/LBay11-7085单独或联合刺激内皮细胞,利用试剂盒检测内皮细胞上清的一氧化氮浓度,并通过Real-Time PCR检测分析eNOS、ET-1、ICAM-1、VCAM-1转录水平的变化,用Western Blot法分析eNOS、 ICAM-1、VCAM-1在蛋白水平的表达变化,用ELISA方法分析ET-1在蛋白水平的表达变化。 6.用SPSS13.0软件进行数据统计分析,组间比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)及独立样本t检验,多重比较采用LSD和SNK法。p<0.05),且诱导作用呈浓度依赖性(p<0.01),且呈浓度依赖性(p<0.01,p<0.05),减弱sPLA2-IIA对NO生产的抑制作用(p0.05)。 6. SB203580对1μg/ml sPLA2-IIA诱导ICAM-1、VCAM-1、ET-1蛋白表达增加的影响不显著(P>0.05),对1μg/ml sPLA2-IIA抑制NO生成的影响也不显著(P>0.05)。 7. Bay11-7085干预组细胞的ICAM-1、VCAM-1、ET-1蛋白的表达水平较1μg/ml sPLA2-IIA单独刺激组显著降低(ICAM-1:p0.05)。 结论： 1. sPLA2-IIA能剂量依赖性地影响内皮细胞功能,促进内皮细胞粘附分子和ET-1的表达,并抑制NO的生成。 2. sPLA2-IIA的水解作用参与其对内皮细胞的损伤过程。 3. sPLA2-IIA主要通过MAPKinase ERK和NF-kB通路上调内皮细胞黏附因子的表达,从而影响内皮细胞黏附功能。 4. sPLA2-IIA主要通过MAPKinase的ERK和JNK通路影响内皮细胞ET-1和NO的生成,从而调节血管舒缩状态。NF-kB也在上调ET-1表达中起到重要作用。
背景：急性胰腺炎(acute pancreatitis.

2±0.6)%和(23.9±0.5)%,套锁纤维舒张百分率高于钩状纤维(t=6.05, P=0.026);(2)促胰液素抗血清可分别阻断促胰液素对套锁纤维和钩状纤维舒张效应,细胞舒张百分数分别为(7.5±0.9)% (t=40.2, P=0.001)和(11.2±1.0)%(t=21.6, P=0.002),两者比较差异有显著性(t=6.39, P=0.024);腺苷酸环化酶激动剂Forskolin分别增强促胰液素对套锁纤维和钩状纤维舒张效应,细胞舒张百分数分别为(40.0±2.3)%(t=4.8, P=0.041)和(30.7±1.8)%(t=4.7, P=0.040);cAMP抑制剂分别阻断促胰液素对套锁纤维和钩状纤维舒张效应,细胞舒张百分数分别为(17.2±1.8)%(t=5.14,

P=0.036)和(14.7±4.3)%(t=4.76, P=0.041);(3)促胰液素使套索纤维与钩状纤维[35S]GTPγS结合率明显升高(52.8±19.5)%(t=3.33, P=0.029)和(44.9±20.9)%(t=3.23, P=0.032),两者比较无明显差异(t=0.83, P=0.455);(4) Gαs抗体可明显抑制促胰液素对套锁纤维和钩状纤维的舒张效应,细胞舒张百分数分别为(9.9±2.33)%(t=7.78, P=0.016)和(8.7±1.9)%(t=4.38, P=0.048);Gαi3和Gαq/11抗体对促胰液素引起套锁纤维舒张效应无明显影响,细胞舒张百分数分别(27.7±4.5)%(t=0.36, P=0.753)和(28.2±2.0)%(t=0.65,

P=0.582);对钩状纤维亦无明显影响,细胞舒张百分数分别为(22.6±1.2)%(t=0.718, P=0.547)和(21.5±4.6)%(t=0.758, P=0.528)。表明与促胰液素耦联的G蛋白类型是Gαs蛋白。 结论:促胰液素受体在人LES套锁纤维和钩状纤维均有表达;促胰液素引起套锁纤维和钩状纤维舒张的规律明显不同,套锁纤维舒张反应强于钩状纤维。部分说明介导促胰液素引起套锁纤维和钩状纤维舒张的信号转导通路为: GS-7340 为什么 Gαs蛋白耦联于腺苷酸环化酶,催化三磷酸腺苷生成环一磷酸腺苷,后者参与平滑肌细胞的舒张。
钩端螺旋体(简称钩体)病是由致病性问号钩体(Leptospira interrogans)感染引起的全球性人兽共患病,也是洪涝、地震等自然灾害中重点的防疫和监控的传染病之一。问号钩体可直接经人或动物皮肤或黏膜迅速侵入宿主体内,随着血流播散至各脏器进行繁殖并导致病变,以黄疸、出血、肾衰竭为其典型的临床症状。迄今为止,尚未发现问号钩体能产生外毒素,已报道的一些细胞毒性因子和弱毒性的内毒素样物质难以解释问号钩体感染所致的病理改变,故其致病机制至今不明。 细胞凋亡是一种主动的、高度有序的死亡过程,涉及一系列基因和蛋白质的参与,其中caspase家族蛋白、MAPK家族蛋白等在凋亡的信号传导中扮演着极其重要的角色。业已发现,许多病原微生物能够诱导宿主细胞凋亡,并以此影响疾病的发生发展进程。有研究表明问号钩体可诱导体外培养的单核-巨噬样细胞凋亡,在豚鼠体内可引起肝细胞凋亡,但其诱导凋亡机制尚不明了。由于诱导宿主细胞凋亡不仅可能与问号钩体毒力有关,还可能涉及问号钩体免疫逃避及宿主体内生存,故深入了解问号钩体诱导细胞凋亡机制对于阐明其致病性有重要意义。 研究目的:探讨问号钩体感染对不同类型宿主细胞的影响及其诱导宿主细胞凋亡的信号传导机制,以期为钩端螺旋体病致病机制的阐明提供实验依据。 研究方法:采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法,检测钩端螺旋体对不同细胞的毒性作用;采用流式细胞术(Annexin V/PI双染法)定量检测问号钩体感染对不同细胞凋亡和坏死的诱导作用;透射电子显微镜观察问号钩体诱导J774A.1和小鼠腹腔巨噬细胞凋亡的形态学变化;采用caspase荧光底物和荧光分光光度计检测问号钩体感染的J774A.1和小鼠腹腔巨噬细胞中caspase的活性变化;western blot法检测问号钩体感染对J774A.1和小鼠腹腔巨噬细胞中PARP、Lamin

和 A/C的裂解及FADD表达的影响;酶联免疫法(ELISA)检测问号钩体感染的J774A.1细胞中JNK和p38MAPK的磷酸化激活情况;应用caspase广谱或特异性抑制剂结合流式细胞术、荧光分光光度计、western blot法,检测这些抑制剂对问号钩体诱导的细胞凋亡和caspase信号传导系统的抑制作用;应用JNK和p38MAPK特异性抑制剂结合流式细胞术、荧光分光光度计、western blot法,检测JNK和p38MAPK在问号钩体诱导J774A.1细胞凋亡中的作用。 结果:(1)问号钩体感染抑制J774A.1、A549和小鼠腹腔巨噬细胞的细胞活性,具有浓度和时间依赖性。问号钩体感染对人脐静脉内皮细胞(EVC304和EVC-EC-C)没有细胞毒性作用。(2)问号钩体诱导J774A.1和小鼠腹腔巨噬细胞凋亡,具有浓度和时间依赖性。与J774A.1细胞相比,小鼠腹腔巨噬细胞对问号钩体的凋亡诱导作用更加敏感。问号钩体以时间依赖方式诱导A549细胞发生坏死,而对人脐静脉内皮细胞(EVC304和EVC-EC-C)无细胞凋亡或坏死诱导作用。(3)Caspase家族抑制剂(Z-VAD-fmk)以剂量依赖方式抑制问号钩体诱导的J774A.1和小鼠腹腔巨噬细胞凋亡。(4)问号钩体诱导J774A.1和小鼠腹腔巨噬细胞内caspase-3、-6、-8、-9的活化、caspase-3、-6底物PARP、Lamin A/C的裂解及FADD蛋白表达上调,并呈时间依赖性效应。(5)Caspase-8抑制剂可以抑制效应caspase-3、-6的活化及其底物的裂解,并进而抑制细胞凋亡,caspase-9抑制剂则对效应caspase-3、-6的活化、caspase-3、-6底物的裂解及细胞凋亡均无抑制作用,说明caspase-8作为启始caspase介导了问号钩体诱导的J774A.1和小鼠腹腔巨噬细胞凋亡,caspase-9可能通过caspase-3的反馈机制而激活,线粒体细胞色素c-caspase-9途径不参与问号钩体诱导的J774A.

L-1的shikonin作用于细胞24 h后可使细胞皱缩、变圆,并出芽形成明显的凋亡小体,且其可时间依赖性的诱导procaspase-3的剪切。35μmol.L-1的shikonin作用于细胞12 h和24 h均可以诱导细胞产生ROS。ROS清除剂NAC和p38抑制剂SB203580可以明显降低shikonin诱导的HeLa细胞的生长抑制和凋亡率;并且5 mmol.L-1 NAC可以上调由shikonin引起的pro-caspase-3的表达降低,下调由shikonin引起的p38蛋白的磷酸化。结论 Shikonin可以诱导HeLa细胞发生凋亡,ROS/p38信号通路参与了其凋亡的过程。
目的:探讨千金藤素(CEP)致Sprague-Dawley(SD)乳大鼠心肌细胞的凋亡作用及其信号途径。方法:应用MTT法检测千金藤素对心肌细胞活性的抑制作用;利用Hoechst 33342染色及Western blotting方法检测凋亡相关信号分子caspase-3,观察CEP致心肌细胞凋亡的作用;采用Western blotting法观测CEP对有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族3个主要信号分子c-Jn氨基端激酶(JNK)、细胞外信号调节激酶(ERK)、p38MAPK磷酸化水平的影响,并利用ERK和p38

selleck合成 MAPK的特异性抑制剂,分别验证两种分子所介导的信号通路在CEP致心肌细胞凋亡中的作用。结果:(1)CEP能够剂量依赖和时间依赖地抑制心肌细胞的活性。(2)CEP作用于心肌细胞,出现细胞核碎裂现象和caspase-3激活。(3)CEP作用下p38 MAPK和ERK磷酸化水平显著增强,JNK的磷酸化状态未发生显著改变。(4)p38 MAPK磷酸化抑制剂SB203580显著减轻CEP对心肌细胞活性的抑制作用;ERK磷酸化抑制剂PD98059不能影响CEP对心肌细胞活性的抑制作用。结论:p38 MAPK参与CEP致心肌细胞凋亡作用。
目的通过培养SD大鼠乳鼠心室肌细胞建立缺氧/复氧(H/R)模型,以模拟在体心肌缺血再灌注损伤,观察脂联素(APN)对心肌细胞缺氧/复氧内质网应激所致心肌细胞损伤的保护机制,为心脏缺血/再灌注损伤的防护提供理论依据。方法采用胰蛋白酶消化法原代培养乳鼠心室肌细胞,通过心肌α肌动蛋白免疫荧光法进行鉴定。选用培养72 h的单层心肌细胞,实验分为5组:正常对照组、单纯H/R组、H/R+30 mg/L APN组、H/R+30 mg/L APN+5 mmol/L SB203580(p38 MAPK抑制剂)组、H/R+5 mmol/L SB203580组。实验终止后,在倒置相差显微镜下观察心肌细胞形态的变化,采用化学比色法测定乳酸脱氢酶(LDH)的释放,用RT-PCR和Western

什么 blot测定内质网应激指标GRP78、Caspase-12的表达。结果与空白对照组相比,单纯H/R后,细胞生长状态较差,内质网应激蛋GRP78、Caspase-12的蛋白和mRNA表达明显增高,LDH的释放量增加;APN预处理后进行H/R,可较大程度地逆转上述指标变化,与H/R组相比具有显著性差异(P
目的探讨重组人红细胞生成素(rhEPO)预处理对缺氧/复氧后SK-N-SH神经母细胞凋亡的影响及丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)信号通路的作用。方法 也许 SK-N-SH细胞随机分成对照组、Cocl2组、rhEPO组和SB203580组。MTT法测定细胞增殖,RT-PCR技术检测bcl-2、caspase-8、和P38MAPK mRNA的表达。结果 rhEPO预处理可以增加SK-N-SH细胞的增殖能力,上调bcl-2和P38MAPK基因的表达,下调caspase-8的表达,而这些调节作用可被SB203580抑制。结论 rhEPO预处理对缺氧/复氧后的SK-N-SH细胞有保护作用,P38MAPK通路起到重要的作用。
目的探讨健脾解毒方对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染人胃癌MKN45细胞环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)表达及其p38MAPK信号通路的调控机制。方法采用实时荧光定量PCR(RFQ-PCR)和Westernblot检测Hp标准株NCTC11637感染对人胃癌MKN45细胞COX-2 mRNA和蛋白表达的影响及健脾解毒方药物血清的调控作用;运用p38MAPK特异性抑制剂SB203580阻断p38MAPK信号通路,观察Hp对MKN45细胞COX-2 mRNA和蛋白表达的影响;观察健脾解毒方对Hp感染激活的p38MAPK信号通路及其下游活化转录调控因子2(activating transcription factor2,ATF-2)表达的影响。结果 Hp感染人胃癌MKN45细胞后,COX-2 mRNA和蛋白表达均明显高于空白对照组(P
目的探讨MAPK信号转导通路在CdCl2、HgCl2诱导RAW264.7细胞低剂量兴奋效应过程中的作用。方法以0、0.0005、0.005、0.05、0.5、5、50和500μmol/L浓度的氯化镉(CdCl2)和氯化汞(HgCl2)分别染毒RAW264.

mda-7。并用其感染肝癌细胞株HepG2、SMMC7721、Hep3B以及正常的肝细胞L02，RT-PCR方法验证MDA-7／IL-24的表达，ELISA方法检测细胞培养上清中MDA-／IL-24蛋白的表达。 结果：通过DNA测序和PT-PCR提示携带MDA-7／IL-24的复制缺陷型腺病毒构建成功，PT-PCR和ELISA方法提示该载体能介导外源基因MDA-7／IL-24在肝癌细胞和正常肝细胞中高效表达。 结论：成功构建了复制缺陷型重组腺病毒载体Ad.mda-7，该载体能介导MDA-7／IL-24基因在人肝癌细胞和正常肝细胞中高效表达。 第二部分Ad.mda-7选择性杀伤肝癌的体外研究 目的利用构建的携带人MDA-7／IL-24基因的复制缺陷型腺病毒Ad.mda-7作为载体，感染肝癌细胞HepG2、SMMC7721、Hep3B、MHCC97L和M6和正常的肝细胞L02，观察该基因对肝癌的选择性杀伤作用，为肝癌的基因治疗提供理论基础。

方法将携带人MDA-7／IL-24基因的腺病毒Ad.mda-7感染人正常肝细胞L02和肝癌细胞HepG2、SMMC7721、Hep3B、MHCC97L和M6。通过RT-PCR方法观察MDA-7／IL-24基因的表达，ELISA方法检测细胞培养上清液中MDA-7／IL-24蛋白的浓度，四甲基偶氮哩蓝染色法(MTT)及Hoechst染色观察MDA-7／IL-24对肝癌细胞的生长抑制和杀伤作用，Annexin-Ⅴ和PI双染后流式细胞仪检测细胞的凋亡，利用流式细胞仪检测细胞周期。 结果RT-PCR提示复制缺陷型腺病毒能介导外源基因MDA-7／IL-24在肝癌细胞株HepG2、SMMC7721、Hep3B、MHCC97L、M6和正常细胞L02中高效表达。ELISA方法检测提示细胞培养上清液中MDA-7／IL-24蛋白的表达。MTT实验结果表明，MDA-7／IL-24能明显抑制各种肝癌细胞的生长，Hoechst染色提示MDA-7／IL-24促进肝癌细胞的凋亡，流式细胞仪提示MDA-7能选择性杀伤肝癌细胞而对正常的肝细胞没有影响，细胞周期分析提示MDA-7／IL-24阻滞肝癌细胞在G2／M期，同时对正常的肝细胞没有促凋亡作用和增殖阻滞作用。 Galunisertib购买 结论：复制缺陷型重组腺病毒载体Ad.mda-7能介导MDA-7／IL-24基因在人肝癌细胞中高效表达，选择性的杀伤肝癌细胞HepG2、SMMC7721、Hep3B、MHCC97L和M6，促进细胞增殖阻滞及诱导肿瘤细胞凋亡而与肿瘤细胞的P53基因的状态无关，同时对正常的肝细胞L02没有任何毒性作用。 第三部分Ad.mda-7选择性杀伤肝癌细胞的机理探讨

目的探索携带MDA-7／IL-24基因的复制缺陷型腺病毒Ad.mda-7选择性杀伤肝癌细胞的机理，为肝癌的基因治疗提供理论基础。 方法将携带人MDA-7／IL-24基因的腺病毒Ad.mda-7感染人正常肝细胞L02和肝癌细胞HepG2。通过RT-PCR方法观察MDA-7／IL-24基因的表达，ELISA方法检测细胞培养上清液中MDA-7／IL-24蛋白的浓度，Western CP-673451分子量 blot检测细胞内MDA-7／IL-24的表达，Hoechst染色观察MDA-7／IL-24对肝癌细胞的生长抑制和杀伤作用，Annexin-Ⅴ和PI双染后流式细胞仪检测细胞的凋亡，利用线粒体分离试剂分离感染后0h、6h、12h和24h时段正常肝细胞L02和肝癌细胞HepG2的线粒体和胞浆蛋白，通过western 可能 blot方法检查胞浆和线粒体凋亡相关蛋白Bcl-2家族和caspase9，线粒体释放的促凋亡蛋白CytochromeC和Smac／Diablo的变化。 结果RT-PCR提示复制缺陷型腺病毒能介导外源基因MDA-7／IL-24在肝癌细胞株HepG2和正常细胞L02中高效表达。ELISA方法检测提示细胞培养上清液中MDA-7／IL-24蛋白的表达，蛋白电泳提示MDA-7蛋白在细胞内表达，而且随着时间的延长表达增强；Hoechst染色提示MDA-7／IL-24促进肝癌细胞的凋亡，流式细胞仪提示MDA-7能选择性杀伤肝癌细胞而对正常的肝细胞没有影响，通过RT-PCR和亚细胞蛋白的分析发现胞浆内抑制凋亡的物质Bcl-2和Bcl-xL表达在HepG2细胞中明显下降，而在L02中没有表达的下降，同时促凋亡蛋白Bax和在肝癌细胞中明显增强，Bak的表达没有明显的变化。同时促进细胞线粒体释放细胞色素C和Smac／Diablo，促进Caspase9的表达增强，从而导致肝癌细胞的凋亡。

结论：复制缺陷型重组腺病毒载体Ad.mda-7能介导MDA-7／IL-24基因在人肝癌细胞中高效表达，选择性的杀伤肝癌细胞HepG2，诱导肿瘤细胞凋亡的机制与线粒体促凋亡物质的释放有关，同时对正常的肝细胞L02没有任何毒性作用。 第四部分：重组腺病毒介导的MDA-7／IL-24和阿霉素联合治疗肝癌的动物实验研究 目的：将重组腺病毒介导的mda-7／IL-24(melanoma differentiation-associated gene-7)和／或阿霉素(adriamycin，ADM)联合治疗裸鼠肝癌，探索基因治疗和化疗相结合治疗肿瘤的新方法。 方法：构建携带人mda-7／IL-24的重组腺病毒载体(Ad.mda-7)，单独用其或ADM以及两者联用对实验性肝癌裸鼠进行治疗，用RT-PCR和western blot检测肿瘤组织中mda-7的表达，用ELISA方法检测裸鼠血清内MDA-7／IL-24蛋白的浓度变化；并观察抗肿瘤效果。 结果：(1)RT-PCR、western blot和ELISA方法可检测到Ad.mda-7+ADM组和Ad.mda-7组中mda-7表达明显增加。(2)Ad.mda-7+ADM组裸鼠肝癌生长抑制率最大值为70.4％，明显高于ADM组和Ad.mda-7组的35.9％和46.3％(P＜0.01)；(3)Ad.mda-7+ADM组裸鼠早期死亡率为0，明显低于ADM组的40％(P＜0.01)；Ad.mda-7+ADM组裸鼠长期生存率为80％，明显高于ADM组和Ad.

7%和3.9%。在34例PIX3CA突变中,17例伴EGFR突变,4例伴KRAS突变。PIK3CA基因突变与PI3K P110α(p=0.0001), p-Akt(p=0.024)以及mTOR(p=0.001)表达呈正相关,但与PIK3CA基因拷贝数无明显相关性(p＝0.463)。仅存在PIK3CA突变患者的总生存时间较pIK3CA-EGFR/KRAs共突变者明显缩短(p=0.004)。在无EGFR/KRAS突变的亚组,PIK3CA突变提示预后不良。本部分研究成果表明,中国人非小细胞肺癌患者PIK3CA基因突变多合并有EGFR或KRAS突变；单一PIK3CA突变提示预后不良：无EGFR/KRAS突变亚组PIX3CA突变提示预后不良。本课题的研究结果可以对临床肺癌癌基因驱动突变筛选提供参考,有利于PIK3CA靶向药患者选择及判断预后,具有临床实用性。第二部分中国人非小细胞FGFR融合基因研究肺癌是世界范围内最常见的癌症致死原因,占所有肿瘤死亡病例的约18%。其中,非小细胞肺癌占所有肺癌的85%左右,大部分非小细胞肺癌患者在被发现时已为晚期从而失去手术根治的机会。随着对非小细胞肺癌遗传学研究的深入,针对特定驱动突变的靶向药物已被证明可以使肿瘤产生明显的消退,并显著延长患者无疾病生存期。近来,致癌融合基因如RET融合基因抑制剂凡德他尼(Vandetanib)和卡博替尼(Cabozantinib),ALK与ROS1融合基因抑制剂克唑替尼(Crizotinib)已被证明可有效治疗特定亚型的肺癌。但是,东亚人群中,仍然有30%的吸烟肺腺癌和88%的肺鳞癌尚没有明确驱动基因突变／融合。新近研究表明,成纤维细胞生长因子受体(FGFR)融合基因与肿瘤生成密切相关,靶向于FGFR的抑制剂有明显抗肿瘤作用并已进入前期临床试验。然而对非小细胞肺癌FGFR融合基因及与其他驱动基因关系的研究罕有报道,中国人非小细胞肺癌FGFR基因融合情况仍不十分清楚。弄清以上问题,将有利于了解中国人群FGFR融合基因现状并有助于FGFR靶向药物患者选择。本项研究第二部分回顾分析复旦大学附属肿瘤医院1328例临床非小细胞肺癌手术切除新鲜冰冻标本,提取RNA,逆转录为cDNA后进行RT-PCR。直接测序检测FGFR1,FGFR2,FGFR3基因融合情况,并分析患者EGFR.KRAs,HER2和BRAF突变、ALK、RET、RoS1融合基因情况以及患者临床病理特征。对研究中发现的FGFR融合基因突变标本与野生FGFR对照标本(连续收集自2011年7月至2012年12月的肺鳞癌样本),以免疫组织化学法(immunohi

没有 也许 stochemical, IHC)检测FGFR1，FGFR2,FGFR3表达。研究发现,1328例非小细胞肺癌中有17例FGFR融合基因,其中15例为FGFR3-TACC3,2例为BAG4-FGFR1,并且与其他基因突变/融合不共存。有吸烟史(P3cm

(P<0.001)患者更易出现FGFR基因融合,腺癌FGFR融合基因样本中多含实体亚型。FGFR融合基因状态与免疫组织化学表达呈正相关,FGFR基因融合与患者的总生存时间以及无复发生存时间无明显相关性。本课题的研究成果表明,中国人群中1.3%的非小细胞肺癌、3.50%的肺鳞癌中存在FGFR基因融合。肿瘤最大径大于3厘米的吸烟鳞癌患者更易出现FGFR融合基因。本课题的研究结果可以对临床肺癌癌基因驱动基因突变／融合筛选提供参考,有利于FGFR靶向药患者选择及判断预后,具有临床实用性。
研究背景肾细胞癌(renal 什么 cell carcinoma, RCC)是泌尿系统常见的恶性肿瘤,近年来发病率呈持续上升趋势,严重威胁人类生命健康。肾细胞癌常发病隐匿,约30%肾细胞癌在初次诊断时已发生转移。肾细胞癌对放化疗不敏感,根治性手术切除是其唯一有效的治疗方式,但是术后肿瘤复发转移率仍较高。肾细胞癌转移(metastatic renal cell carcinoma, mRCC)预后不良,5年生存率<0.001,P<0.001)；同时,肾细胞癌转移灶组织PIK3R1基因蛋白表达量亦显著低于肾细胞癌原发灶组织PDGR1蛋白表达量(P<0.001,P<0.001)。786-mut1和786-mut2细胞的PIK3R1基因蛋白表达量也降低。与野生型细胞相比,A-704-mutl和A-704-mut2细胞的PIK3R1基因mRNA的表达量亦均显著下降(P<0.001,P<0.001)。A-704-mut1和A-704-mut2细胞的PIK3R1基因蛋白表达量也降低。与野生型细胞相比,786-mutl和786-mut2细胞的平板克隆数均显著性增加(P<0.001,P<0.001)。与野生型A-704细胞相比,A-704-mut1和A-704-mut2细胞形成的干细胞球数亦均显著增多(P<0.001,P<0.001,P<0.001)、(P<0.001,P

<0.001,P<0.001)、(P<0.001,P<0.001)、(P<0.

pylori,感染状态仍然持续存在,其中的免疫调控机制仍不清楚。 微小RNA (microRNAs, miRNAs)是真核生物中一类长度约22个核苷酸的非编码小分子RNA,其编码基因存在于基因组的基因间隔区或内含子中,成熟miRNA由较长的可折叠形成发夹结构的前体转录物经Dicer酶或类似的内切核酸酶加工形成。miRNA通过与靶mRNA的3’-非翻译区(3’-UTR)互补或部分互补结合,使mRNA降解或介导其翻译抑制,参与基因转录后水平调控,在细胞发育、增殖、分化和肿瘤发生等生物学行为中发挥重要作用。 研究表明,miRNAs的表达作为细胞接收外源或内源压力信号后的一种早期反应,参与调控机体免疫应答。但目前关于miRNAs在细菌感染与免疫中的作用还鲜有报道。H. pylori感染引起的由胃上皮细胞等介导的固有免疫应答成为抗感染的第一道防线,因此,本研究首先建立稳定的H. pylori感染人胃上皮细胞模型;利用miRNAs芯片检测H.

pylori感染前后胃上皮细胞的miRNAs表达谱变化,以表达显著差异的miRNAs为研究对象,采用Northern杂交和实时定量PCR技术对其表达进行鉴定;深入研究H. pylori感染诱导miRNAs差异表达的分子机制;并通过生物信息学预测和报告载体系统鉴定其靶基因,详细研究miRNAs在H. pylori感染中调控炎症反应的作用机制。本研究以miRNAs为切入点,展开“H. pylori感染、miRNAs变化与调控炎症”的作用模式和机制研究,对进一步阐明H. pylori感染中的免疫调控机制具有重要意义,更为利用miRNAs靶向干预或治疗炎症相关分子导致的损伤及增强对H. pylori清除提供新的思路。 方法: 1、H. pylori感染相关miRNAs的筛选及鉴定。 建立H. pylori标准株感染人胃上皮GES-1细胞模型;利用miRNAs芯片检测H. pylori感染前后胃上皮细胞的miRNAs表达谱变化,筛选出表达显著差异的miRNAs,并采用Northern杂交和实时定量PCR技术对其在多个H. pylori感染胃上皮细胞模型以及H. pylori感染患者胃黏膜组织中的表达进行鉴定。 CB-839临床实验 2、miRNAs在H. pylori感染中差异表达的机制研究。 以表达显著差异的miRNAs为研究对象,通过多诱导因素综合分析、启动子分析、荧光素酶实验、信号通路抑制剂实验等方法,分析miRNAs在H.

和 pylori感染中表达变化的分子机制。 3、miRNAs在H. pylori感染中的作用研究。 结合生物信息学预测、荧光素酶验证实验、GFP报告载体验证实验、实时定量PCR、Western blot等方法鉴定miRNAs在胃上皮细胞中的靶基因;通过体外过表达或抑制表达miRNAs、RNA干扰、免疫荧光等实验深入研究miRNAs在H. pylori感染中调控炎症反应的作用机制。 结果: 1、H. pylori感染相关miRNAs的筛选及鉴定。 H. pylori 26695标准株与人胃上皮细胞GES-1共培养24h后,细胞形态呈明显“蜂鸟样”改变;细胞分泌大量促炎细胞因子Interleukin-8(IL-8);表达启动炎症反应的关键酶Cyclooxygenase-2(COX-2),成功建立感染模型。miRNAs芯片结果表明,H. pylori感染引起GES-1细胞一系列miRNAs的表达改变,其中表达上调2倍的有:miR-155、miR-146a、miR-16、miR-92b、miR-30b;表达下调2倍的有:miR-324、miR-181b。以表达变化最明显的miR-155和miR-146a为研究对象,通过Northern杂交和实时定量PCR技术对其表达进行验证,结果与芯片结果一致;且miR-155和miR-146a在其他多个H.

pylori感染胃上皮细胞模型中表达均明显上调(P
急性肺损伤(acute lung injury, ALI)/急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)为临床常见的危重症,主要表现为急性呼吸窘迫、顽固性低氧血症和非心源性肺水肿。ALI/ARDS可发生于任何年龄段的患者,通常由严重感染、创伤、休克等因素诱发。但迄今为止其发病机制尚未完全阐明。近年来,病理研究结果显示,ALI/ARDS发生时受损伤最明显的结构是肺泡上皮,尤其是肺泡Ⅰ型上皮细胞(AT-1)对损伤更敏感,而且这种损伤常常发生在ALI/ARDS的早期阶段。 小窝蛋白(Caveolin, Cln)是一个相对分子质量为21-24kD的膜蛋白,高度富集于蛋白小窝膜(Caveolea, Cle),是Cle的标志性蛋白,具有多种潜在功能,在维持Cle形态、结构、功能中起重要作用。目前发现,哺乳动物中至少存在3种Cln基因家族产物,即Cln-1,Cln-2及Cln-3。其中Cln-1广泛存在于肺泡Ⅰ型上皮细胞膜,并有证据表明Cln-1/Cle在肺泡上皮屏障功能变化中扮演重要角色。 很少 本研究应用pRNAi-u2.6-Cln-1慢病毒载体转染原代培养肺泡Ⅰ型上皮细胞(AT-1)和c57BL6小鼠,并观察Caveolin-1基因对LPS致炎AT-1细胞和小鼠的影响及作用机制,为临床防治ALI/ARDS提供新的思路。 研究内容和方法: 1.小鼠Cln-1基因的克隆及载体构建:PCR法扩增Cln-1 cDNA全长基因序列,将其克隆至慢病毒表达载体pRNAi-u2.6上并进行慢病毒包装。 2.肺泡Ⅰ型上皮细胞分离、培养:PE标记的AT-1细胞特异性抗体RTI40标记细胞,采用抗PE的免疫磁珠阳性筛选AT-1细胞,流式细胞仪测定纯度。 3.慢病毒载体pRNAi-u2.6-Cln-1转染AT-1及鉴定:慢病毒载体pRNAi-u2.6-Cln-1病毒上清转染AT-1细胞,转染后在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光,流式细胞仪测定转染效率,用Western-blotting法鉴定转染AT-1细胞中目的蛋白表达情况。 4. Cln-1基因对LPS致炎AT-1细胞的影响及作用机制: (1) LPS致炎AT-1细胞模型:AT-1细胞分为转染目的基因的实验组及转染空载体的对照组,均给予LPS刺激,浓度10μg/ml,分2hr和4hr两个时相点。 (2) ELISA法测定LPS致炎细胞上清液的炎性因子TNF-α、IL-6表达水平。 (3)荧光定量PCR法检测LPS致炎AT-1细胞cPLA2和p38 MAPK mRNA表达变化。 (4) Western blotting法检测LPS致炎AT-1细胞cPLA2、p38 MAPK蛋白表达变化。 (5) EMSA法检测LPS致炎AT-1细胞核蛋白NF-κB表达变化。 (6)特异性阻断cPLA2、p38 MAPK、NF-κB后,细胞上清液TNF-α、IL-6表达水平变化及相互作用。 5.观察Cln-1基因对LPS致炎小鼠的影响及作用机制: (1)慢病毒载体pRNAi-u2.

Growing evidence shows that CIH and hypertension are strongly related,involving markers or pathways indicative of systemic inflammation,such as high-sensitivity C-reactive protein(hs-CRP),interleukin-6,nuclear factor-kappa B,tumor necrosis factor-α,interleukin-8 and p38 mitogen-activated protein kinase(MAPK)dependent 点击此处 pathways.Oxidative stress also plays an important role in this process,including in the activation of polymorphonuclear neutrophils.However,the pathophysiological and clinical significance of systemic inflammation in CIH and hypertension is not proven.This

review article highlights the relationship between CIH and hypertension through systemic inflammation and the current interventions available in Chinese medicine,to offer a background for the future treatment of OSAS-related hypertension with integrative medicine.
目的探讨丹参酮ⅡA(Tanshinone,TanⅡA)对缺血再灌注(IR)损伤大鼠细胞凋亡和血脑屏障通透性的影响及与p38MAPK通路的关系。方法 60只大鼠随机分为假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(IR组)、TanⅡA低剂量治疗组、TanⅡA高剂量治疗组,线栓法建立局灶性脑缺血再灌注模型。TanⅡA高、低剂量组于术前连续灌胃给予高、低剂量TanⅡA 3d,每日1次。各组于脑缺血120min再灌注24h,采用免疫组化法观察大鼠额顶部皮质磷酸化p38MAPK和MMP-9表达;TUNEL法检测神经细胞凋亡,检测伊文斯蓝(EB)含量变化。结果(1)与Sham组相比,IR组磷酸化p38MAPK和MMP-9明显升高(P<0.05);与IR组比较,TanⅡA高、低剂量治疗组磷酸化p38MAPK和MMP-9表达均降低,且高TanⅡA组明显低于低TanⅡA组(P均<0.05);(2)与Sham组相比,IR组凋亡细胞明显增加;与IR组比较,TanⅡA高、低剂量治疗组凋亡细胞均减少,且高TanⅡA组明显低于低TanⅡA组(P均<0.05)。(3)与Sham组比较,IR组脑组织EB含量明显升高;与IR组比较,TanⅡA高、低剂量治疗组脑组织EB含量明显降低(P<0.05),且高TanⅡA组明显低于低TanⅡA组(P均
随着人们生活行为,饮食结构及人口老龄化的改变,糖尿病(DM)的发病率与日剧增,成为严重威胁人类健康的慢性代谢性疾病,据国际糖尿病联盟统计,2000年全球有DM患者约1.51亿,而估计到2030年全球将5亿人患DM,DM是DM肾病
近年一些研究发现,内源性和外源性的硫化氢都具有促进血管新生和伤口愈合的作用。在体外培养的细胞和活体的研究中,一定剂量的硫化氢可促进血管内皮细胞增殖、迁移和黏附功能,从而促进微血管的形成。其机制可能与激活血管内皮生长因子及其下游的信号通路有关。本文就硫化氢促血管新生作用及其相关机制的研究进行综述。
背景:内皮祖细胞为血管新生的前体细胞,通过促血管新生作用治疗糖尿病血管病变有着良好的前景。目的:探讨糖尿病对内皮祖细胞移植治疗缺血性疾病过程中促血管新生作用的影响。方法:制备糖尿病大鼠模型,提取糖尿病和正常大鼠供体骨髓单个核细胞体外定向培养为内皮祖细胞。同时建立糖尿病及正常大鼠下肢缺血模型,并于缺血病变部位局部移植糖尿病或正常大鼠内皮祖细胞或PBS进行对照。移植后定期应用ELISA方法检测病变部位血管内皮生长因子含量,应用免疫组化方法计数病变部位微血管密度。结果与结论:①受体相同,移植物不同时:移植糖尿病大鼠来源或正常大鼠来源内皮组细胞后,下肢缺血组织中血管内皮生长因子水平及微血管密度比较,差异无显著性意义(P>0.05)。②移植物相同,受体不同时:正常大鼠移植内皮祖细胞后下肢缺血组织中血管内皮细胞生长因子含量和微血管密度均高于糖尿病组。说明在体外定向培养和病变部位局部注射条件下,糖尿病对骨髓来源内皮祖细胞移植促血管新生作用无明显影响,而对血管新生所处的病变部位微环境有明显影响。
自1864年可卡因首次成功应用于眼科手术的表面麻醉以来,局麻药临床应用已超过一个多世纪的历史。局麻药神经传导阻滞麻醉的功效已在临床实践中获得广泛认可,但其所引起的神经功能障碍也引起越来越多麻醉医师的关注。本文就局麻药神经毒性影响因素和机制研究进行综述,为局
目的探讨内毒素性急性肺损伤(ALI)过程中P38丝裂原活化蛋白激酶(P38

通常 并且 MAPK)的表达。方法腹腔注射脂多糖(LPS)20mg/kg建立小鼠ALI模型。心脏穿刺查血气分析,并获取肺脏标本,观察肺组织形态学改变。采用免疫组织化学法和Western blot技术检测小鼠肺组织中磷酸化P38MAPK的表达。结果与对照组比较,ALI组各时相点小鼠肺组织中磷酸化P38MAPK阳性表达明显增加,且在2h达到峰值,主要分布于浸润的炎症细胞、上皮细胞、血管内皮细胞。结论内毒素性ALI过程中启动了P38MAPK信号传导通路。
目的探讨高血糖加重脑梗死机制与Ras/Raf/丝裂原激活蛋白激酶(MEK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号传导通路的关系。方法通过大鼠尾静脉注射链脲佐菌素(STZ)及大脑中动脉闭塞(MCAO)术造成大鼠糖尿病脑缺血模型。将大鼠分成假手术组、健康大鼠脑缺血组、2型糖尿病(T2DM)大鼠脑缺血组、PD98059组,每组12只。PD98059组于MCAO术前30min尾静脉注射PD98059(3mL/kg)。MCAO术后2h给各组大鼠做神经学评分,取脑组织标本。应用免疫组织化学、蛋白质印迹法(Western blotting)测定大鼠磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)蛋白的表达,应用TUNEL检测神经细胞凋亡情况。结果除假手术组外,其他3组均有不同程度的神经功能缺损、神经细胞凋亡,且差异有统计学意义(P<0.