研究目的：(1)探讨周期性牵张力对血管平滑肌细胞ACE2表达的影响；(2)明确ACE2在病理性牵张力(18%

elongation, 1Hz)调节人主动脉平滑肌细胞生物学功能中的作用；(3)明确病理性牵张力(18% elongation, 1Hz)调节血管平滑肌细胞ACE2表达的分子机制。3.研究方法3.1.人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)培养与处理3.1.1.平滑肌细胞培养人主动脉平滑肌细胞株购自美国菌种保藏中心ATCC (American Type CellCollection),待平滑肌细胞生长至完全融合后,用吸管吸掉旧培养基,PBS冲洗细胞两遍,在细胞培养瓶中加入适量事先预热的0.25%胰蛋白酶,显微镜下观察,至平滑肌细胞变圆后,轻轻拍打至细胞脱落,加入适量完全培养基中和胰酶,吹打细胞,使平滑肌细胞全部掉落,离心5min (1000r/min)。离心结束,用吸管吸掉上清,加入新的完全培养基,转入新的细胞培养瓶中,将培养瓶放入含5%C02的37℃细胞培养箱中继续培养。待平滑肌细胞贴壁完全后,显微镜下观察细胞形态及密度。3.1.2.平滑肌细胞干预体外培养的4-7代HASMCs用于实验。将平滑肌细胞种至铺有Ⅰ型胶原的Flexcell六孔板中。待平滑肌细胞在六孔板中的密度达到80%-90%时,更换无血清SMCM继续培养24小时。牵张力刺激平滑肌细胞前再次更换新的完全培养基。在37。C,5% 不 C02条件下,使用Flexcell 5000-Tension系统刺激平滑肌细胞。不同牵张力描述如下：(1)生理性牵张力:10% elongation,频率为1Hz；(2)病理性牵张力：18% elongation,频率为1Hz。3.2.动物模型的建立我们应用大鼠腹主动脉缩窄模拟血管压力负荷升高,20只雄性Wistar大鼠(200-250g)随机分为两组：腹主动脉缩窄组(n=10)和对照组(n=10),分别于术后3、5及7天后取材。3.3.实时荧光定量PCR分析刺激结束后利用Trizol法提取平滑肌细胞中的总RNA,并测定RNA浓度。根据试剂盒说明,使用TaKaRa公司的cDNA合成试剂盒进行逆转录反应,再使用TaKaRa公司的实时定量PCR试剂盒进行PCR反应。反应结束后得到Ct值,用相对定量的方法计算2-△△Ct,并分析数据。以测定平滑肌细胞内ACE2及ACE的mRNA表达情况。3.4.蛋白质印迹法(Western

时间 Blot)提取不同刺激后的平滑肌细胞及大鼠组织蛋白,4摄氏度离心10分钟,99摄氏度晃动加热10分钟,SDS-PAGE电泳,转膜,5%脱脂奶粉封闭,4摄氏度一抗孵育过夜,室温下二抗孵育2小时,ECL化学发光,利用Photoshop分析对应蛋白条带的灰度值。3.5.ACE2活性测定刺激结束后,提取平滑肌细胞蛋白,以7-Mca-YVADAPK(Dnp)作为反应底物测定不同刺激条件下ACE2的活性变化情况。3.6.酶联免疫吸附测定(ELISA)收集不同刺激条件下平滑肌细胞上清液,ELISA法检测上清中血管紧张素1-7及血管紧张素Ⅱ的含量。3.7.构建含目的基因的病毒载体由上海吉凯基因化学技术有限公司构建过表达ACE2基因腺病毒载体(Ad-ACE2),以携带绿色荧光蛋白的腺病毒空载体(Ad-GFP)为对照组。3.8.5-澳脱氧尿嘧啶核苷法(BrdU)用Brdu法检测ACE2在病理性牵张力(18%

elongation,1Hz)调节HASMCs增殖中的作用。将HASMCs种在Flexcell六孔板中,进行不同刺激。刺激结束后,吸掉旧SMCM,加入适量配制好的BrdU labeling medium作用6小时。将平滑肌细胞用95%7,醇在-20摄氏度固定30分钟,经anti-Brdu working solution4摄氏度孵育过夜、anti-mouse-Ig-fluorescein标记的二抗37摄氏度避光孵育30分钟,4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-Diaxnidino-2-Phenylindole, CP-673451临床试验 DAPI)染核后封片,光学显微镜下观察、拍照。3.9.细胞划痕实验用细胞划痕实验检测ACE2在病理性牵张力(18% elongation, 1Hz)调节HASMCs迁移中的作用。3.10.细胞转染利用Invitrogen公司的Lipofectamine2000分别转染不同浓度的Dicer siRNA、 ATF3 siRNA、Negtive control siRNA及miR-421 inhibitor和mimics,观察ACE2mRNA及蛋白的表达变化,验证ATF3及miR-421是否参与ACE2表达调节。DicersiRNA、ATF3 siRNA、Negtive control siRNA及miR-421 inhibitor和miR-421 mimics均由上海吉玛公司合成。3.11.