本实验成功地建立了酶切富集PCR-焦磷酸测序检测NSCLC患者癌组织及外周血KRAS基因突变技术。酶切富集-PCR通过引入特异的限制性内切酶，能更有效地使KRAS突变基因得到富集；在此基础上，联合焦磷酸测序技术，能大样本、高通量、精确地检测KRAS基因突变，能有效为NSCLC患者是否适合TKI治疗提供实验依据，给患者带来最大获益及避免医疗资源的浪费。
肺癌是全世界癌症相关死亡的第一原因，而肺癌中大约80%是非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer, NSCLC），晚期NSCLC患者的5年生存时间小于15%。表皮生长因子受体（epidermal growth factor

receptor, EGFR）是第一个于非小细胞肺癌中筛选出的重要驱动基因，肿瘤细胞根据“EGFR通路”进行繁殖、增长与侵袭转移等生物学相关行为。多项III期临床试验研究证明，三磷酸腺苷(Association Tennis Professional,ATP)竞争性酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine Kinase Inhibitors, TKIs)已成为NSCLC患者伴有EGFR酪氨酸激酶区21与19外显子激活突变临床选择治疗的一线治疗方案。目前市场上EGFR-TKIs药物主要有埃克替尼、吉非替尼和厄罗替尼等。EGFR-TKIs具有抑制癌细胞生长、血管生成和侵袭转移等生物学行为，其主要通过竞争细胞内EGFR酪氨酸蛋白激酶区域的ATP结合部位，可逆性阻碍EGFR酪氨酸激酶的激活，达到抑制癌症生长的作用。肿瘤组织标本来源的DNA结合直接测序法已成为EGFR基因突变检测的“金标准”。进行EGFR基因突变检测需要获取满意的组织标本，但是临床实践中肿瘤组织样本的获得受到很多因素的限制，很多患者不能取得满意的组织样本进行EGFR基因突变检测。已有大量研究探讨利用患者外周血游离DNA替代组织标本来源的DNA检测EGFR基因突变的可能性。但是不同标本来源DNA中EGFR基因突变检测结果的一致性尚未明确。因此，本研究利用卡方检验法分析晚期NSCLC患者外周中EGFR基因突变与组织标本中EGFR基因突变结果的一致性，旨在探讨利用患者外周血游离DNA代替组织标本DNA检测EGFR基因突变的可靠性，以及分析其与临床病理基线的相关性，为不能进行组织EGFR突变检测的患者使用分子靶向治疗提供证据。本课题的第二部分采用卡方检验分析初治NSCLC患者肺原发灶组织样本EGFR基因突变情况，及其与患者的临床病理资料指标的关联性。以此来探讨可预测组织样本中EGFR基因突变的临床指标，以期达到利用临床指标取代组织标本EGFR基因突变检测可能性，对于部分难以获取肿瘤组织标本进行EGFR基因突变检测的患者，利用临床指标筛选出对TKIs治疗效果较好的有利人群，为临床实现TKIs诊疗提供一定的理论证据。约有25%-54%NSCLC患者在肿瘤细胞进展阶段会发生脑转移。有研究表明NSCLC脑转移发生可能与其EGFR突变相关，但NSCLC脑转移对肺原发灶EGFR突变的预测作用，目前尚无报道。因此，本研究最后拟通过临床样本和离体实验进一步探讨NSCLC脑转移与肺原发灶EGFR突变的关联性，利用NSCLC脑转移预测肺原发灶EGFR基因突变状况，为未能进行EGFR突变检测伴有脑转移的NSCLC患者使用EGFR-TKIs治疗提供一定的证据，为筛选EGFR-TKIs治疗有效的优势人群提供理论依据。

Pazopanib体内 哪里 研究目的 1.探讨NSCLC患者外周血来源的游离DNA中EGFR激活突变与石蜡组织配对样本来源DNA中EGFR基因突变检测结果的一致性，旨在探讨利用患者外周血游离DNA代替组织标本DNA检测EGFR基因突变的可靠性，外周血EGFR基因突变与患者临床特征的关联性，为不能进行组织EGFR突变检测的患者使用分子靶向治疗提供证据。 2.研究初治NSCLC患者肺原发灶组织样本EGFR基因突变状况，及其与患者临床病理资料指标的相关性，利用临床指标代替EGFR基因突变检测，从未能进行EGFR基因突变检测的初治NSCLC患者中筛选出使用分子靶向治疗效果较好的有利人群，为实现患者个体化TKIs治疗提供一定的理论依据。 研究伴有脑转移初治NSCLC患者特有的临床特征与肺原发灶组织样本EGFR基因突变的相关性，从未能进行EGFR基因突变检测且伴有脑转移的初治NSCLC患者中筛选出对分子靶向治疗治疗有效的有利人群。 3.研究NSCLC患者发生脑转移对肺原发灶组织样本EGFR基因突变的相关性，利用NSCLC脑转移预测肺原发灶EGFR基因突变状况，为未能进行EGFR基因检测且伴有脑转移的NSCLC患者采纳TKIs治疗提供一定的证据。 研究方法与内容 1. NSCLC患者血浆与组织样本中EGFR基因突变状况的比较

收集第三军医大学附属大坪医院肿瘤中心2011年6月至2013年12月446例经病理确诊为非小细胞肺癌患者的临床资料。采用DHPLC技术检测446例患者外周血中EGFR基因突变，Sanger直接测序技术检测从446例中筛选出40例配对组织标本EGFR基因突变。卡方检验分析血浆与组织中EGFR基因突变的一致性及其与患者临床特征的关系。 2.初治NSCLC患者肺原发灶EGFR基因突变状态与其临床病理特征的相关性研究 收集2011年7月至2013年5月第三军医大学第三附属医院肿瘤中心253例初次就诊的NSCLC临床病理资料。使用ARMS法（人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒）检测253例患者的肺原发灶组织样本EGFR基因突变。并用X2方法分析肺原发灶EGFR基因突变状态及其与253例NSCLC患者临床特征之间的关联性。 AZD8055小白鼠 253例初治NSCLC中有31例出现脑转移，收集脑转移灶特有的临床资料，运用卡方检验方法分析肺原发肿瘤EGFR基因突变与患者脑转移患者特有的临床特征之间的关系。 3. NSCLC脑转移与肺原发灶EGFR基因突变状况的相关研究 显微镜观察EGFR基因野生型A549人肺腺癌细胞与EGFR基因19外显子缺失突变型HCC827细胞形态学差异；采用MTT方法比较A549与HCC827细胞增殖差异；应用细胞体外侵袭实验Transwell技术判断两株细胞侵袭水平的高低。 4.所有EGFR基因突变与临床基线之间的关系应用卡方检验（Chi-square tsst,X2）检验或Fisher确切概率法以及Logistic回归分析。P＜0.05为有统计学意义。所有分析用SPSS16.0软件包完成。两种不同细胞株MTT OD值、两种细胞侵袭个数、两种细胞迁移数目的比较采用one-wayAOVA分析。 研究结果 1. NSCLC患者血浆与组织样本中EGFR基因突变状况的比较 446例血浆总样本与40例组织样本中EGFR基因突变率各为19.7%，37.5%两者之间有统计学意义（P=0.