利用免疫细胞化学和Western Blotting方法检测未处理的食管癌EC9706细胞中PKA催化亚基、CREB的磷酸化状态,同时用PKA特异性的抑制剂H89处理细胞2 h,观察活化的PKA、CREB的改变。 2.利用免疫细胞化学和Western Blotting方法检测未处理的食管癌EC9706细胞中p38MAPK、ATF2的磷酸化状态,同时用p38抑制剂SB203580处理细胞2 h,观察活化的p38、ATF2的改变。 3.PKA特异性的抑制剂H89和p38抑制剂SB203580单独和联合处理EC9706细胞16 AZD4547化学结构 h,利用免疫细胞化学和Western Blotting方法观察DNA polβ表达的变化。 4.提取未处理EC9706细胞、H89和SB203580分别处理16 h的EC9706细胞的核蛋白,经凝胶电泳阻滞实验(EMSA),分析EC9706细胞中活化的CREB、ATF2与DNA polβ启动子中CRE元件的结合活性。 结果 1.EC9706细胞中PKA-CREB通路处于激活状态 Western Blotting与免疫细胞化学结果显示,未处理的EC9706细胞中含有活化的PKA和CREB,H89可以降低其磷酸化水平。

2.EC9706细胞中p38-ATF2通路处于激活状态 Western Blotting与免疫细胞化学结果显示,未处理的EC9706细胞中含有活化的p38和ATF2,抑制剂SB203580可以降低其磷酸化水平。 3.EC9706细胞中激活状态的PKA和p38MAPK通路参与调节DNA polβ的表达 为证实EC9706细胞中PKA、p38MAPK通路的激活与DNA polβ的表达存在一定的关系,我们采用阻断信号通路的方法,分别单独和联合使用PKA抑制剂H89和p38抑制剂SB203580作用EC9706细胞16 h,观察DNA

polβ的表达的变化。免疫细胞化学和免疫印迹实验结果显示,未处理的EC9706细胞中有一定水平的DNA polβ的表达,H89和SB203580可以部分降低细胞中polβ的表达,两者联合使用,polβ的表达降低更明显。EMSA结果显示,EC9706细胞中活化的CREB、ATF2与polβ启动子中的CRE元件有较强的结合活性。 第二章阻断DNA polβ表达的信号通路对食管癌EC9706细胞生物学特性和对顺铂敏感性的影响 方法 1.PKA特异性抑制剂H89和p38MAPK特异性抑制剂SB203580单独和联合处理EC9706细胞24 h,用倒置显微镜观察细胞形态学变化;用Annexin V-FITC和PI双染色,流式细胞仪检测细胞凋亡率;水溶性四氮唑(WST-8)测定抑制剂作用24和48 h细胞增殖改变。 寻找更多 2.在EC9706细胞中加入H89和SB203580单独和联合预处理1 h,再加入顺铂培养24 h,用倒置显微镜观察细胞形态学变化;用Annexin V-FITC和PI双染色,流式细胞仪检测细胞凋亡率;WST-8测定抑制剂作用24和48 h细胞增殖改变。 结果 1.阻断PKA和p38信号通路、降低DNA polβ表达对食管癌EC9706细胞生物学特性的影响 H89和SB203580单独作用EC9706细胞,部分细胞出现细胞形态缩小,细胞增殖减慢;当H89和SB203580联合作用,EC9706细胞出现细胞形态缩小,胞质凝缩,细胞漂浮数明显增加,细胞数量下降,增殖受到抑制。 细胞增殖实验结果显示,与对照组相比,H89组和SB203580组细胞的24 h、48 h存活率均下降(P＜0.05),当H89与SB203580共同作用于细胞时,细胞存活率进一步下降(P＜0.05)。 Annexin V-FITC和PI双染色,细胞凋亡检测结果显示,EC9706在H89和SB203580单独作用24 h,均表现为促进细胞凋亡;当H89和SB203580联合使用时,促进细胞凋亡和坏死作用更加显著。 2.阻断PKA和p38信号通路、降低DNA polβ表达增加食管癌EC9706细胞对顺铂的敏感性 化疗药顺铂单独作用EC9706细胞,出现细胞形态缩小,漂浮细胞数量增加,细胞增殖较慢;当H89和SB203580分别与顺铂联合作用,EC9706细胞出现细胞形态缩小,胞质凝缩,细胞漂浮数明显增加,细胞数量下降,增殖明显受到抑制,而H89、SB203580共同联合顺铂使用时,这种变化尤为明显。 很少 细胞增殖实验结果显示,与单用顺铂相比,当H89或SB203580与顺铂联合作用于细胞时,细胞存活率下降,细胞的增殖受到抑制(P＜0.05),增加了对顺铂的化疗敏感性;当三者联合,抑制更明显。

细胞凋亡检测结果显示,与单独使用顺铂的对照组相比,当H89或SB203580联合顺铂使用时,细胞总凋亡率增加(P＜0.05);尤其是H89、SB203580和顺铂三者联合时更明显。 结论 1.一定浓度的AOH能够产生抑制细胞增殖、引起细胞周期阻滞、造成DNA损伤等急性反应和和克隆形成率增加,并能够诱导DNA polβ表达增高。 2.AOH诱导NIH3T3细胞中的PKA-CREB信号通路和p38MAPK-ATF2信号通路激活,上调DNA polβ基因表达。 3.在食管癌细胞EC9706中PKA-CREB信号通路和p38MAPK-ATF2信号通路处于激活状态,两者共同促进DNA polβ的表达。 4.阻断PKA和p38MAPK信号途径,降低DNA polβ表达,改变EC9706细胞生物学特性,增加对化疗药顺铂的敏感性,有可能成为食管癌治疗的辅助治疗方法。
第一章人膀胱移行细胞癌中HIF-1α、VEGF、MMP-2和Bcl-2的表达及其相关性的研究 目的：探讨HIF-1α、VEGF、MMP-2和Bcl-2在BTCC中的表达及其意义。 方法：用免疫组化的方法检测HIF-1α、VEGF、MMP-2和Bcl-2在42例BTCC和9例正常膀胱组织中的表达情况,并分析其与BTCC临床病理因素的关系。 结果：BTCC组织中HIF-1α, VEGF, MMP-2和Bcl-2的阳性率分别为61.9%(26/42),69.0%(29/42),61.9%(26/42)和64.3%(27/42)高于正常膀胱组织的22.2%(2/9)(P<0.01),YC-1组和YC-1+SB203580组比较亦有显著性差异(P<0.01)；缺氧培养环境下,则分别为0.346±0.009,0.128±0.009,0.201±0.008,0.221±00007,YC-1组和YC-l+PD98059组比较有显著性差异(P<0.